骨髓間充質干細胞細胞膜片復合富血小板血漿促進種植體周圍骨組織再生的研究

劉茜 周煒 劉歡 王忠山 李雪健 趙銥民

目前，提高種植體骨結合的方法主要為通過物理、化學修飾等方法進行種植體表面改性。但放療區骨組織由于骨細胞及微血管受損而導致種植體周圍骨改建和再生能力降低，僅單純依賴種植體表面改性，得到的效果并不明顯。在前期的研究中，本課題組發現將BMSCs細胞膜片包裹于種植體周圍構建組織工程化的種植體可促進種植體的骨結合［1］，但單純使用BMSCs細胞膜片而沒有添加促進血管生成的因子無法在放療區得到很好的促進骨組織再生的效果。將內皮祖細胞（EPCs）與BMSCs構建復合細胞膜片可以在促進成骨的同時促進血管的再生，包裹種植體種植于放療區可獲得較好的促進骨結合的效果［2］，但仍存在植入時膜片易脫落或膜片聚集于種植體上部而使作用范圍較小等問題［3］，并且對于缺損區的形貌維持和體積支撐很有限，當種植體周圍存在較大的骨組織缺損時則無法很好的實現骨組織再生，因此需要進一步研究如何優化細胞膜片的應用。富血小板血漿（PRP）含有大量促進成骨和成血管的細胞因子，近年來開始應用于骨組織再生［4］。有研究表明，使用PRP處理種植體可以提高種植體的骨結合與穩定性［5］。將BMSCs與富血小板血漿復合用于犬下頜骨種植體周圍，取得較好的骨組織再生效果［6］。PRP在鈣離子、凝血酶等的激活下可以形成凝膠狀結構，本實驗將PRP與BMSCs細胞膜片聯合使用，構建可注射的復合凝膠，研究其促進種植體周圍骨組織再生的可能性。

1 材料與方法

1.1 主要材料和設備

α-MEM培養基（Gibco，美國）；胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、PBS緩沖液、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、雙抗、4%多聚甲醛固定液、戊巴比妥鈉（Sigma，美國）；CO2培養箱（Thermo Forma，美國）；體式顯微鏡（LEICA M205FA，德國）；正置顯微鏡成像系統（Nicon CX J30，日本）；場發射掃描電子顯微鏡（S-4800，Hitachi，日本）；純Ti種植體（Φ2 mm，長6 mm，西安有色金屬研究院）；β-TCP方塊（武漢華威有限公司）；小動物Micro CT（Inveon CT，Siemens AG，德國）；硬組織切片機（LEICA SP1600，德國）；6周齡BALB／c裸鼠；2周齡SD大鼠（空軍軍醫大學動物實驗中心）。

1.2 BMSCs的獲取、鑒定及細胞膜片的制備

2周大SD大鼠，過量戊巴比妥鈉注射處死，取股骨及脛骨，全骨髓法培養BMSCs。取第三代BMSCs用于后續實驗，倒置顯微鏡下拍照。成骨誘導：取第三代BMSCs，當細胞生長融合約90%后，培養基更換為成骨誘導液（15%FBS，1%雙抗，50μg／ml左旋抗壞血酸，10－7mol／L地塞米松，10 mmol／L b-甘油磷酸鈉），進行成骨誘導培養，3周后茜素紅染色。成脂誘導：取第三代BMSCs，當細胞生長融合約90%后，培養基更換為成脂誘導液（15%FBS，1%雙抗，0.5 mmol／L IBMX，1μmol／L地塞米松，200μmol／L吲哚美辛，10μmol／L胰島素），誘導2周后進行油紅O染色。

細胞膜片培養：取第三代BMSCs，當細胞生長融合約80%，培養基更換為成膜誘導液（10%FBS，1%雙抗，50μg／ml Vc）。培養10～14 d至膜片形成。將BMSCs細胞膜片切割為大小約為1 mm×1 mm的顆粒。取少量膜片在體式顯微鏡下觀察并固定后做石蠟切片及HE染色。

1.3 PRP的制備

取體重300 g左右SD大鼠，1%戊巴比妥鈉麻醉后固定，備皮，于第三、第四肋間將注射器刺入心臟取動脈血，按照9∶1的體積加入3.8%檸檬酸鈉抗凝液混勻。1 700 r／min離心10min，取上清液，3 200 r／min離心5 min，棄3／4上清液，混勻，即可制得PRP。

1.4 BMSCs細胞膜片-PRP復合物的構建及體內移植

1.4.1 將BMSCs細胞膜片（初始細胞數量為5×106個／培養皿）切割后收集，離心，PBS清洗，加入250μl PRP及25μl凝血酶，混勻，迅速吸入注射器內。30～40 s即可凝固為凝膠狀。取部分凝膠快速轉移至含有4%多聚甲醛的離心管內，固定24 h后凍干、掃描電鏡觀察其形態結構。

取中心有圓柱形孔隙（直徑3 mm，長4mm）的β-TCP小方塊（5 mm×5 mm×5 mm），將種植體置入其中，分別將 BMSCs膜片-PRP復合物（BMCS＋PRP組）、單純BMSCs細胞膜片碎片（BMCS組）、單純PRP凝膠（PRP組）使用16G針頭注射入種植體與材料之間的孔隙中。

1.4.2 取9只BALB／C裸鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，消毒雙側皮膚，剪開背部皮膚約2 cm，鈍性分離皮下組織，隨機將3組復合物分別植入（n＝6），縫合皮膚并消毒。

1.4.3 Micro-CT分析 飼養8周后取材，取樣本于4%多聚甲醛中固定24 h后進行Micro-CT掃描（分辨率為21μm），觀察種植體表面新骨形成并進行三維重建。選擇灰度為8000區分種植釘和β-TCP材料，選擇灰度為4000區分骨結構和β-TCP，選擇灰度為1500區分骨組織與空腔。感興趣區域為β-TCP和種植體之間的空間，計算骨體積／總體積（BV／TV）。

1.4.4 不脫鈣硬組織切片及VG染色 將固定后的樣品梯度酒精脫水，置入二甲苯中透明24 h，依次轉入滲透液I、II、III中分別浸泡48 h，最后進行包埋、切片，切片厚度為50μm。對切片進行 VG染色后觀察、拍照，采用image pro plus6.0軟件分析種植體周圍骨面積（BA）。計算公式為感興趣區域內新生骨面積／總面積，感興趣區域為種植體與β-TCP材料之間的空隙。

1.5 統計學分析

所有數據采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。實驗數據采用 one-way ANOVA檢驗比較組間差異；若結果有差異，采用Turkey HSD檢驗進行兩兩比較，P＜0.05時認為有統計學意義。

2 結 果

2.1 BMSCs鑒定

BMSCs為短梭型，呈集落樣生長（圖1A）。成脂誘導染色可見有脂滴形成（圖1B）。成骨誘導染色可見紅染鈣化結節形成（圖1C）。誘導14 d后，可見細胞膜片形成，可揭起。將細胞膜片剪碎后，在體視顯微鏡下觀察，可見膜片呈半透明狀，大小約1 mm×1 mm（圖1D）。HE染色可見細胞膜片碎片由2～3層細胞及大量細胞外基質構成，厚度30～50μm（圖1E）。

2.2 BMSCs-PRP復合物的制備

BMSCs膜片顆粒與PRP、凝血酶混合后約40 s可形成淡黃色凝膠狀結構（圖2A）。掃描電鏡下觀察可見網狀纖維結構的PRP與大量BMSCs細胞聚集的膜片，PRP充填于細胞膜片所構成的框架之間（圖2B）。將BMSCs與PRP復合凝膠注入種植體與β-TCP間后可得種植體-BMSCs膜片-PRP復合體（圖2C）。

圖1 BMSCs形態與鑒定及BMSCs膜片顆粒的形態學觀察（×100）Fig 1 Characterization of BMSCs and morphological observation of BMSCs sheet fragments （×100）

圖2 BMSCs膜片-PRP復合物的構建Fig 2 Construction of BMSCs sheet fragments-PRP complex

2.3 Micro-CT結果

Micro-CT結果可見BMSCs＋PRP組種植體周圍有較多骨質形成。而BMSCs組與PRP組種植體周圍幾乎無骨質形成（圖3A）。BV／TV結果BMSCs＋PRP組為（0.122 9±0.055 65），BMSCs組為（0.010 82±0.008 37），PRP組為（0.014 63±0.003 44），BMSCs＋PRP組顯著高于BMSCs組及PRP組，具有統計學差異（P＜0.05）。BMSCs組與PRP組無明顯差異（圖 3B）。

2.4 硬組織切片結果

硬組織切片經VG染色（圖4A）后可見BMSCs膜片＋PRP組種植體周圍有紅染的新生骨形成，骨內可見骨陷窩及骨細胞。新生骨周圍可見較多尚未完全礦化的類骨質，其中含有豐富的細胞核較大的成骨細胞及血管，并有新生骨伸向種植體與金屬表面接觸。BMSCs膜片組可見較多纖維結締組織，未見新生骨形成。PRP組僅在種植體上部有少量纖維組織。對硬組織切片種植體周圍骨面積（BA）進行分析（圖 4B），BMSCs＋PRP組 BA（0.082 6±0.006 44）顯著高于BMSCs組（0.009 3±0.002 99）及 PRP組（0.003 7±0.001 78）（P＜0.05）。BMSCs組與 PRP組無明顯差別（P＝0.316）。

3 討 論

在本實驗中，通過將BMSCs膜片與PRP混合構建了可注射的凝膠狀結構，注射于種植體周圍，研究發現了使用BMSCs與PRP復合物組在種植體周圍有更多的新生骨形成；證實了聯合使用BMSCs膜片與PRP可以促進種植體周圍骨組織再生。

圖3 Micro CT觀察及分析Fig 3 Micro CT observation and analysis

在本實驗中，使用β-TCP材料模擬種植體植入種植窩的物理狀態，以便將細胞膜片與PRP復合物置于種植體周圍，并利于取材后進行不脫鈣硬組織切片；術后8周可見CS＋PRP組產生了最多的新生骨；Micro-CT結果顯示在CS＋PRP組中，種植體與材料的孔隙中有較多骨質形成；硬組織切片結果也驗證了這一點，并且可見部分新生骨沿種植體表面生長。同時，也可觀察到在紅染的新生骨周圍有較多藍紫色類骨質及未完全骨化的纖維結構，表明其正在礦化。單純BMSCs膜片組可見大量纖維結締組織，但并未見到有礦化的膠原及血管形成，表明單純BMSCs細胞膜片的成骨效果較差。對照組PRP組僅在種植體上部有少量纖維結締組織，可能是由于裸鼠的粘膜上皮細胞與材料接觸而形成。

圖4 β-TCP／BMSCs-PRP／種植體組織學觀察及檢測Fig 4 Histological examinations ofβ-TCP／BMSCs-PRP／implant constructs

實驗結果表明PRP在BMSCs細胞膜片成骨的過程中起到了重要的作用。PRP作為自身血液提取的富含高濃度血小板的血漿，獲取較易，沒有免疫原性，并且包含多種成骨相關的生長因子，包括PDGF、TGF-β1、VEGF、IGF-1等，在骨形成和愈合的初始階段有促進作用［7］。并且可以促進細胞的增殖，基質的重建及血管再生［8］。PRP可以提高 BMSCs的ALP活性和COL-I型膠原的表達［9］。同時PRP可以提高BMSCs中VEGF表達，促進血管的生成，而豐富的血管可以為新生骨的形成帶來更多的營養與氧氣，新生血管也可以刺激成骨細胞及成骨細胞前體細胞的分化，從而獲得更好的骨組織再生［10］。有研究將PRP與BMSCs用于促進骨質疏松模型的大鼠的骨缺損，可以獲得更好的骨組織愈合和再生［11］。對于放療區骨組織而言，放療所造成的血管損傷是造成成骨細胞、骨髓細胞等在較長時間內數量減少及功能受損的主要原因，因此，促進血管再生在放療區骨組織再生中尤為重要［12］。在本實驗中，通過將BMSCs膜片與PRP復合，在成骨的同時可以看到更多的新生血管形成，從而實現更好的骨組織的再生。

BMSCs是骨組織工程中常用的種子細胞之一，已有大量研究使用BMSCs與支架材料進行骨的再生。通過Vc連續誘導法可以獲得具有一定厚度的BMSCs細胞膜片。有研究表明BMSCs細胞膜片因其有細胞與細胞的接觸及大量的細胞外基質而有更好的成骨效果，在BMSCs膜片中，成骨相關基因如骨鈣素、成血管相關基因如VEGF等的表達都較BMSCs細胞更多，與PRP復合可以提高骨組織的再生和重建［13］。在本實驗中，將BMSCs細胞膜片切割為含有大量細胞及細胞外基質的細胞聚集體，與PRP復合構建為可注射的三維凝膠狀結構；這種三維結構較單純的細胞膜片可以使細胞膜片與PRP充分接觸，更好的促進細胞的增殖與分化；同時這樣具有一定流動性的凝膠狀結構可使用注射器將注射到種植體周圍，可以解決單純使用細胞膜片包裹種植體所存在的植入時膜片脫落等問題，對于種植體周圍的骨缺損也可促進骨組織的再生。

綜上，本研究發現BMSCs與PRP可以促進種植體周圍骨組織的再生。為進一步證明BMSCs細胞膜片與PRP復合物在促進種植體周圍成骨的能力，在后續實驗中將進行大動物種植缺損的模型構建及在放療等因素的影響下，BMSCs膜片與PRP復合物是否具有更好的促進種植體骨結合及周圍骨組織再生的能力。

［1］Zhou W，Han C，Song Y，et al.The performance of bone marrow mesenchymal stem cell——Implant complexes prepared by cell sheet engineering techniques［J］.Biomaterials，2010，31（12）：3212－3221.

［2］劉歡，周煒，任楠，等.內皮祖細胞對骨髓間充質干細胞－種植體復合物成骨能力的影響［J］.實用口腔醫學雜志，2016，32（2）：155－160.

［3］Liu H，Zhou W，Ren N，et al.Cell sheets of Co-cultured endothelial progenitor cells and mesenchymal stromal cells promote osseointegration in irradiated rat bone［J］.Sci Rep，2017，7（1）：3038.

［4］Shayesteh YS，Eshghyar N，MoslemiN，etal.The effectof platelet-rich plasma on healing of palatal donor site following connective tissue harvesting：A pilot study in dogs［J］.Clin Implant Dent Relat Res，2012，14（3）：428－433.

［5］Kundu R，Rathee M.Effect of platelet-rich-plasma（PRP）and implant surface topography on implant stability and bone［J］.JClin Diagn Res，2014，8（6）：ZC26－ZC30.

［6］Yamada Y，Ueda M，Naiki T，et al.Autogenous injectable bone for regeneration withmesenchymal stem cells and platelet-rich plasma：Tissue-engineered bone regeneration［J］.Tissue Eng，2004，10（5－6）：955－964.

［7］Fernandes G，Yang S.Application of platelet-rich plasma with stem cells in bone and periodontal tissue engineering［J］.Bone Res，2016，4：16036.

［8］Georgakopoulos I，Tsantis S，Georgakopoulos P，et al.The impact of platelet rich plasma（PRP）in osseointegration of oral implants in dental panoramic radiography：Texture based evaluation［J］.Clin Cases Miner Bone Metab，2014，11（1）：59－66

［9］Duan J，Kuang W，Tan J，et al.Differential effects of platelet rich plasma and washed platelets on the proliferation ofmouse MSC cells［J］.Mol Biol Rep，2011，38（4）：2485－2490.

［10］Leotot J，Coquelin L，Bodivit G，et al.Platelet lysate coating on scaffolds directly and indirectly enhances cellmigration，improving bone and blood vessel formation［J］.Acta Biomater，2013，9（5）：6630－6640.

［11］Wei B，Huang C，Zhao M，et al.Effect of mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma on the bone healing of ovariectomized rats［J］.Stem Cells Int，2016，2016：9458396.

［12］Teng MS，Futran ND.Osteoradionecrosis of the mandible［J］.Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg，2005，13（4）：217－221.

［13］Qi Y，Niu L，Zhao T，et al.Combiningmesenchymal stem cell sheets with platelet-rich plasma gel／calcium phosphate particles：A novel strategy to promote bone regeneration［J］.Stem Cell Res Ther，2015，6：256.