口腔鱗狀細胞癌中Dickkopf-3基因的表達及甲基化狀態

張素欣 張鑫 陳中 李天客 包陽 鄭晶 張雨溫

口腔頜面部惡性腫瘤中90%以上是口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell cancer，OSCC）［1］。據統計，中國每年新發的口腔頜面部惡性腫瘤病例約4.65萬人，5歲和70歲是兩個相對發病最高點［2］。雖然多學科綜合序列治療模式運行多年，患者的5年生存率仍僅停留在60%左右，尋找代表腫瘤侵襲性及復發率的個性化生物標志物，可以促進針對性精準治療，減少復發率，提高生存率［3］。

DKK-3是Wnt信號傳導通路的分泌性拮抗劑之一［4］。有學者發現 DKK-3基因在食管癌［5］、肺癌［6］等組織中存在異常甲基化，但該基因在口腔黏膜鱗癌中的表達及甲基化狀態鮮有問津，本實驗通過應用RT-PCR和MSP技術檢測口腔鱗狀細胞癌組織中DKK-3基因mRNA的表達和啟動子甲基化狀態，并分析mRNA表達和甲基化與臨床資料之間的關系，探討該基因的存在狀態在口腔鱗癌發生發展的關系，為腫瘤靶向治療提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

隨機選取河北醫科大學第四醫院口腔科2014-09～2015-12期間51例經手術治療的初診原發口腔鱗癌患者為研究對象，標本均經病理證實。所有標本均為術后立即取材，－80℃冰箱中凍存。發病部位包括舌、牙齦、頰等部位，年齡在31～88歲之間，中位年齡58歲，男女性別比為1.43∶1。Ⅰ期9例，Ⅱ期27例，Ⅲ期6例，Ⅳ期9例。本實驗已獲得患者及家屬的知情同意。

1.2 主要試劑

5-氮-2′-脫氧胞苷 （5-aza-2deoxycytidine，5-AzadC）、氫醌、亞硫酸氫鈉（Sigma，美國）；蛋白酶 K（Merck，德國）；Wizard DNA純化試劑盒（Promega，美國）；Trizol（Invitrogen，美國），引物（北京賽百勝公司合成）；即用型免疫組織化學SP試劑盒（SP-9000）（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 MSP法檢測 提取組織DNA并進行亞硫酸氫鹽處理，設計甲基化及非甲基化引物進行MSP檢測，上下游引物各包含3個CG位點（圖1）。DKK-3基因甲基化引物為：上游 5′-GGGGCGGGCGGCGGGGC-3′，下游 5′-ACATCTCCGCTCTACGCCCG-3′；非甲基化引物為：上游 5′-TTAGGGGTGGGTGGTG GGGT-3′，下游5′-CTACATCTCCACTCTACACCCA-3′。PCR反應條件為95℃預變性10 min后，94℃變性45 s，59℃退火45 s，72℃延伸45 s，40個循環后，72℃繼續延伸10 min。用經甲基化酶（Sss I）處理以后的基因組DNA作為甲基化的陽性對照，陰性對照則用滅菌雙蒸水取代DNA模板進行PCR。另隨機選取10%標本進行重復實驗以驗證結果的可靠性。

圖1 DKK-3基因的CpG島分布Fig 1 CpG island of DKK-3 gene distribution

1.3.2 RT-PCR檢測 按Trizol試劑說明書提取組織總RNA，參照逆轉錄試劑盒 （Reverse Transcription SystemA 3500，Promega公司）說明將RNA逆轉錄成cDNA。用于檢測DKK-3基因mRNA的引物為：上游5′-ACAGCCACAGCCTG GTGTA-3′， 下 游 5′-CCTCCATGAAGCTGCCAAC-3′（120 bp）。內參照 GAPDH的引物為：上游 5′-AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游 5′-AGGGGTC ATTGATGGCAACA-3′（104 bp）。PCR反應條件為：95℃預變性3 min后，94℃變性45 s，59℃退火45 s，72℃延伸45 s，共35個循環，最后72℃繼續延伸5 min。PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，GAPDH作為內參照。

1.4 統計學處理

應用SPSS 13.0軟件進行數據處理及統計學分析，計量資料用配對t檢驗方法，計數資料用χ2檢驗。均采用雙側檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 DKK-3基因mRNA在OSCC組織及正?？谇火つぶ械南鄬Ρ磉_量（圖2）

DKK-3基因mRNA在OSCC組織中的相對表達量為（0.41±0.27），在其對應正?？谇火つぶ邢鄬Ρ磉_量為（0.50±0.29），二者差異顯著（P＜0.05）。

DKK-3基因mRNA在OSCC組織中的相對量表達情況與臨床特征之間的關系（表1）。

吸煙組、臨床Ⅲ期、Ⅳ期組、有淋巴結轉移組DKK-3基因 mRNA的相對表達量分別為（0.22±0.16）、（0.28±0.19）、（0.24±0.17），均明顯低于對照組（P＜0.05），表達量與性別和年齡無關。

圖2 DKK-3 mRNA在口腔鱗癌及正常黏膜組織中的表達Fig 2 The expression of DKK-3 mRNA in OSCC and normal oral mucosa tissue

表1 DKK-3 mRNA的表達與口腔鱗癌患者臨床病理特征間的關系Tab 1 The relationship between DKK-3 mRNA expression and clinical data in OSCC tissue

2.2 口腔鱗癌組織和正?？谇火つぶ蠨KK-3基因啟動子區的甲基化狀態（圖3）

DKK-3基因啟動子區在OSCC組織中的甲基化率為49.0%（25／51），明顯高于其對應正?？谇火つそM織的甲基化率7.8%（4／51）（P＜0.05）（表 2）。

OSCC組織中DKK-3基因啟動子區甲基化情況與臨床特征之間的關系（表3）。

圖3 DKK-3基因在口腔鱗癌及正常黏膜組織中的甲基化狀態Fig 3 Methylation analysis of DKK-3 gene in OSCC and normaloralmucosa tissue

表2 DKK-3在口腔鱗癌及正?？谇火つそM織中不同的甲基化狀態Tab 2 The difference of the DKK-3 methylation between OSCC and normal oralmucosa tissue

吸煙組、臨床Ⅲ期、Ⅳ期組、有淋巴結轉移組的甲基化率分別為 64.3%、73.3%、50.0%，均明顯高于對照組，甲基化率與性別、年齡及有無淋巴結轉移無關（P＞0.05）。

2.3 DKK-3基因mRNA相對表達量與甲基化陽性率的關系

DKK-3基因mRNA在甲基化陽性病例中的相對表達量為0.30±0.21，在對照組表達量為0.51±0.29（P＜0.05）。

表3 DKK-3甲基化狀態與口腔鱗癌患者臨床病理特征間的關系Tab 3 The relationship between DKK-3 methylation and chinical data of OSCC

3 討 論

表觀遺傳是通過DNA甲基化、組蛋白修飾等方式有選擇性地調控目的基因的表達，促使腫瘤的發生［7］。其中DNA甲基化的基因表觀修飾方式，集中發生在CpG島，啟動子區CpG島的高甲基化是引起抑癌基因表達下調的重要機制之一［8］。

DKK-3屬于DKK家族，位于染色體11P15.1位點，全長47 100 bp，該家族大都通過競爭性結合特異性受體來有效的抑制Wnt信號傳導通路［9］，從而參與調控機體的生物學行為。DKK-3在肝癌、乳腺癌等組織中表現為下調和缺失［10－11］，本實驗發現，DKK-3基因mRNA在OSCC中的相對表達量明顯低于對照組，而且該基因在癌組織中表達量的高低與臨床分期及淋巴結的轉移明顯有關，表明DKK-3表達降低可能是口腔癌發展過程中的一個重要事件，隨著病變的進展，DKK-3基因mRNA的表達逐漸降低甚至沉默，提示DKK-3基因在OSCC中可能作為抑癌基因而存在，推測它的調控機制可能是因為DKK-3基因編碼的蛋白是Wnt受體復合物的對抗物，DKK-3基因表達的下調使其編碼的蛋白無法有效對抗Wnt受體復合物，使得游離態 β-catenin在胞內聚集，Wnt通路被異常激活，作用于下游靶基因，從而調控腫瘤細胞的生物學行為［12］。也就是說，DKK-3基因可能是通過調控Wnt信號傳導通路中關鍵因子βcatenin的表達來異常激活經典Wnt通路，從而促進口腔癌的發生。

那么是什么原因導致了OSCC組織中DKK-3基因表達的下降呢？本研究應用MethPrimer軟件對DKK-3基因進行預測分析，結果顯示DKK-3基因含有9個外顯子，該基因的啟動子區和第1外顯子區富含CpG島，因此有理由懷疑該基因的異常甲基化可能是其表達下調的機制之一，于是又檢測了DKK-3啟動子區的甲基化狀態，結果顯示OSCC組織中DKK-3基因的甲基化率明顯高于對照組，而且與臨床分期有關，說明隨著口腔癌的不斷進展，DKK-3基因甲基化狀態也不斷突顯，警示不良預后。另外，DKK-3基因mRNA在其甲基化陽性病例中的相對表達量顯著低于對照組，分析原因可能是啟動子區CpG島5＇末端調控序列甲基化后阻礙了轉錄因子與啟動子的結合，降低了該基因的轉錄水平，從而使其表達下降甚至不表達，即DKK-3基因啟動子區CpG島的高甲基化可能是導致該基因表達下降甚至不表達的關鍵因素之一，間接參與了口腔癌的發生與發展。

因此，本研究認為以DNA甲基化為代表的表觀遺傳沉默是口腔癌發生發展中的重要機制之一，可以應用去甲基化藥物逆轉腫瘤細胞中DNA的異常高甲基化狀態，修復抑癌基因的正常表達，從而控制腫瘤的發生與發展［13－14］，但其可行性需進一步探索及證實。

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