人牙髓干細胞與根尖牙乳頭干細胞miRNAs表達譜的差異分析

林詩晗 胡雪剛 呂紅兵

人牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）和根尖牙乳頭干細胞（stem cells from the apical papilla，SCAPs）是牙髓和牙髓牙本質復合體形成的基礎，為牙根的再生提供保障。研究表明，DPSCs和SCAPs都具有牙本質形成和分化能力，具有相似的牙本質發生和生長因子受體基因，STRO-1和牙本質形成標記物DSPP、BGP等及生長因子 FGFR1、TGFβR1共同表達于體外培養的細胞中［1］。但SCAPs有著更高的溴脫氧尿苷吸收率、更高的倍增數、更強的組織再生能力，表達更高水平的抗細胞凋亡蛋白［2］。推測，SCAPs可能是一種比DPSCs更早期、更優越的牙源性干細胞，在牙髓再生、牙體修復，甚至骨組織的重建中具有更廣闊的應用前景。miRNAs的發現為干細胞的干性研究提供了嶄新的研究領域。miRNAs是一類在真核生物中長20～25個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，成熟的miRNAs通過核酸互補序列識別特異性靶mRNA，使之降解或抑制其翻譯，從而抑制蛋白質的合成，達到調控基因表達的目的。

DPSCs和SCAPs是組織工程理想的細胞來源，SCAPs來源于根尖孔未閉合的年輕恒牙，是組織構建的首選。miRNAs在DPSCs和SCAPs中干性的維持作用，目前尚不明確。本研究旨在分析DPSCs和SCAPs中差異表達的miRNAs及其靶基因預測，為進一步闡明miRNAs在DPSCs和SCAPs干性維持中的調控機制提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

超凈工作臺SW-CJ-IFD型（上海力申科學儀器有限公司）；光學顯微鏡、酶標儀（Heraeu，德國）；高速臺式離心機（Eppendorf，德國）；－80℃超低溫冰箱（SANYO，日本）；α-MEM、胎牛血清、1 000 U／ml青霉素、1 000 U／ml鏈霉素、胰蛋白酶（Gibco，美國）；Ⅰ型膠原酶、dispase II酶（Sigma，美國）；成人骨髓間充質干細胞成骨、成脂誘導分化培養基（Cyagen，美國）；鼠抗人STRO-1單克隆抗體（R＆D systems，美國）；免疫磁珠（Miltenyi Biotec，德國）；ALP檢測試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；茜素紅、油紅O染色液（南京森貝伽生物科技有限公司）；TruSeq Small RNA Sample Prep Kit（Illumina，美國）。

1.2 牙髓細胞和根尖牙乳頭細胞的培養

選取臨床17～20歲健康的第三磨牙，無菌條件下取出牙髓或分離根尖牙乳頭組織。剪碎，CD酶（I型膠原酶3 mg／ml，dispase II酶 4 mg／ml）37℃消化 30 min，終止消化后1 000 r／min離心5 min，細胞篩過濾，獲得單細胞懸液。加入含10%胎牛血清的 α-MEM培養液，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養7～10 d。細胞生長達70%～80%時用胰蛋白酶消化傳代，標記為第1代，取第3代細胞進行后續實驗。

1.3 免疫磁珠分選DPSCs和SCAPs

分別取1×107對數生長期的DPSCs和SCAPs，鼠抗人STRO-1單克隆抗體2.5μg／106cells標記；每107細胞加入 60μl running buffer、20μl FcR blocking、20 μl免疫磁珠，混勻后4℃孵育15 min；置LS分選柱中，STRO-1表達陽性細胞結合于分選柱中的磁珠，陰性細胞位于分選液中。收集分選液，其中即為非DPSCs或非SCAPs。準備陽性標本收集管，取下LS柱，加入5 ml running buffer后用活塞快速推下，收集DPSCs和SCAPs。采用CCK-8法檢測細胞增殖，連續7 d，實驗重復3次。以檢測天數為橫坐標，A值為縱坐標繪制DPSCs和SCAPs的生長曲線。

1.4 DPSCs和SCAPs的誘導分化鑒定

將細胞克隆胰蛋白酶消化后，以1×104個／孔接種于6孔板。細胞生長至80%匯合后改為成骨、成脂誘導液培養21 d。取誘導后和正常培養的DPSCs、SCAPs按照說明書進行ALP測定，茜素紅（4%多聚甲醛室溫固定30 min后用1%pH4.1茜素紅染色液染色10 min，蒸餾水快速沖洗，干燥，封固后顯微鏡下觀察）和油紅O染色（固定后的細胞用新配制的油紅O染色液染色15 min，60%異丙醇漂洗30 s，蘇木素染色2 min，流水沖洗，晾干后觀察）鑒定其分化能力。

1.5 二代測序技術檢測miRNAs表達譜

分別取DPSCs和SCAPs，加入Trizol混合后抽提總RNA。使用 TruSeq Small RNA Sample Prep Kit，按照廠家的標準流程，主要步驟如下：使用NanoDrop測定RNA的濃度、瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性、以及Agilent2100 Bioanalyzer測定RNA的RIN值；完成RNA質檢后，使用特異性接頭連接miRNAs的3＇與5＇端，逆轉錄合成cDNA第一鏈。隨后進行15個循環的PCR擴增，擴增產物經PAGE電泳質檢、切膠純化、Qubit濃度測定以及2100質檢后，miRNAs文庫構建即告完成。待測miRNAs文庫在cBot上完成簇類生長，將流通池轉移到HiSeq 2000型測序系統上，按照標準流程進行二代測序及數據分析。實驗重復2次。

1.6 miRNAs靶基因及基因功能生物信息學分析

利用miRNAs靶基因數據庫進行靶基因預測。經t檢驗統計分析，對于細胞中表達差異有統計學意義的 miRNAs，應用 DIANA-microT、miRanda、miRBase、PicTar和TargetScanS等軟件聯合進行生物信息學分析，搜索靶基因?；贕ene Ontology數據庫，對靶基因進行GO分類和KEGG pathway的功能分析，進行顯著性基因功能篩選。

2 結 果

2.1 DPSCs和 SCAPs的分離

通過酶消化法獲得的細胞懸液，7～10 d后達到70%～80%匯合。免疫磁珠篩選STRO-1表達陽性的DPSCs和SCAPs，DPSCs為成纖維樣細胞，胞漿突起呈梭形。SCAPs與DPSCs形態類似，沒有顯著差異（圖1）。繪制DPSCs和SCAPs生長曲線，對數生長期內SCAPs細胞數增長較快（圖2）。

2.2 DPSCs和SCAPs的誘導分化鑒定

DPSCs和SCAPs的ALP測定值分別為（1.819±0.017）和（1.582±0.026）；礦化誘導后的細胞，ALP測定值分別為（3.302±0.024）和（3.431±0.018）。誘導前后比較，差異有統計學意義（P＜0.05），表明礦化誘導后的兩種細胞都具有成骨細胞的特性。另外，成骨誘導液連續培養10 d左右，細胞局部增厚，似復層生長，密度增高。21 d后進行茜素紅染色，可見明亮橙紅色礦化結節，周邊界限不清（圖3）。成脂誘導液連續培養21 d后可見脂滴形成（圖4）。

圖2 DPSCs和SCAPs的生長曲線Fig 2 The growth curves of DPSCs and SCAPs

圖3 成骨誘導后茜素紅染色結果 （×100）Fig 3 Alizarin red staining after osteogenic induction（×100）

圖4 成脂誘導后油紅O染色結果 （×100）Fig 4 Oil Red O staining after adipogenic induction （×100）

2.3 DPSCs和SCAPs中miRNAs表達譜差異分析

應用 R package DESeq2（Version 1.6.1）軟件，在每組數據中選取變化倍數值 ＞1.5，P＜0.05的 miRNAs。與DPSCs相比，SCAPs中顯著下調的miRNAs有7個，分別是 hsa-miR-224-5p、hsa-miR-1247-5p、hsamiR-3065-3p、hsa-miR-452-5p、hsa-miR-767-5p、hsa-miR-4284、hsa-miR-146a-5p，無顯著上調miRNAs（圖 5）。

圖5 DPSCs和SCAPs差異表達miRNAs火山圖Fig 5 The volcano plots of the differentialmiRNA expression between DPSCs and SCAPs

2.4 差異表達miRNAs調控的靶基因

結合生物信息學方法，對miRNAs可能調控的靶基因進行預測。篩選其共同miRNAs，得到SCAPs中表達明顯下調的miRNAs調控的關鍵基因27個：IBA57、POU2F1、PDXK、TPM3、C1orf21、ATXN1、FZD3、ADCY1、ONECUT2、SLC7A1、PRKCA、RIMS3、RAB3B、CBL、SLC1A2、STX3、ASB1、SEPT3、SLC7A1、SFMBT2、SH3BP2、 KPNA4、 KLF13、 NFIB、 IPO9、 CDS2、CSNK1G1。

2.5 差異表達miRNAs靶基因的功能分析

基于Gene Ontology數據庫，對靶基因進行GO分類和KEGG pathway分析。GO分類研究表明，差異表達miRNAs主要調控細胞器活性、細胞內和細胞間信號分子傳遞；影響蛋白活性、蛋白結合和蛋白跨膜轉運活動；調節代謝及生物合成，影響細胞分化過程中的形態改變（圖6）。KEGG分析結果顯示，差異表達miRNAs參與Wnt信號通路、調節干細胞多能性信號通路、細胞壽命調節通路，影響細胞增殖、細胞凋亡和細胞多能性；也參與TRP通道炎性介質監管、mTOR信號通路等。對七個miRNAs靶基因分別進行分析，結果表明，hsa-miR-224-5P的調控與細胞生長、蛋白分解代謝有關；hsa-miR-1247-5p調節信號分子的傳遞、細胞多能性；hsa-miR-3065-3p調節細胞凋亡；hsamiR-452-5p調節神經嵴干細胞分化；hsa-miR-4284調節染色質組成、細胞遷移；hsa-miR-146a-5p調節轉錄因子活性，等等。

圖6 靶基因在細胞組成（P＜0.05）、分子功能（排名前30）和生物過程（排名前30）中的功能富集情況Fig 6 The possible roles of the target genes in cellular component（P＜0.05），molecular function（top 30）and biological process（top 30）

3 討 論

DPSCs和SCAPs是口腔醫學研究領域重要的組織干細胞。Lei等［2］將大鼠 SCAPs與 DPSCs比較發現，無論體外培養還是體內移植，前者成牙本質和成骨潛能均高于后者。Huang等［3］體外培養人 SCAPs和DPSCs，以中空牙根為載體，移植到免疫功能缺陷的小鼠體內，結果表明根管內有帶血管的牙髓樣組織形成，同時根管牙本質壁內有新生牙本質沉積。SCAPs再生所形成的牙本質無論是厚度還是成牙本質細胞排列方式都遠遠好于DPSCs。DPSCs與SCAPs是干性狀態不同的兩種干細胞，SCAPs可能是組織工程更理想的細胞來源。miRNAs參與生命過程中一系列的重要進程，包括細胞分化、干性維持等。目前，通過基因芯片、二代測序等方法對miRNAs和干細胞的研究發現，干細胞中存在各自特異的miRNAs譜，其表達既具有時空特異性，也具有組織和細胞特異性，對干細胞的自我更新和未分化狀態的維持具有重要意義，對干細胞的繼續分化和增殖也具有顯著的調控作用。

目前已證實miRNAs在多種牙源性干細胞中發揮了高效調控作用，DPSCs中miRNAs的研究較為深入。Gay等［4］發現DPSCs經體外成骨誘導，RUNX2活性增高，miR-218能夠調控 RUNX2的表達；Gong等［5］發現DPSCs向內皮細胞分化時共有47個miRNAs的表達變化，差異表達miRNAs的靶基因，被證實與轉錄調控、血管形態發生、細胞骨架蛋白生成、MAPK和Wnt信號通路等生物學行為和功能有關；Li等［6］發現miR-143和miR-135抑制劑可誘發DPSCs的肌原性分化；Gardin等［7］發現miR-196a的表達能促進鈦表面DPSCs的成骨分化。但miRNAs與SCAPs的研究尚少，miRNAs在DPSCs和SCAPs中的作用如何，是如何影響兩者干性狀態的，目前尚未見報道。

本研究表明，在差異表達miRNAs中，大部分miRNAs調控與神經系統發育、神經元增殖和分化相關。已有研究證實，miR-224可通過Npas4分子調控神經元分化；miR-452在神經嵴細胞中大量存在，調控干細胞分化［8］；miR-146在小鼠中促進神經嵴細胞的增殖和分化［9］。DPSCs和SCAPs均來源于神經嵴細胞，這可能是miRNAs在發育早期就對細胞進行了不同程度的干預和調控。下調的miRNAs在SCAPs中低表達，抑制細胞分化，使其能夠長期維持干性狀態不變，這種猜測有待后續的實驗驗證。Fan等［10］研究表明miR-224可通過調節離子轉運體表達來調控釉質礦化。在本實驗功能分析中，miRNAs調節轉錄因子活性、信號分子傳遞等，在干細胞中，差異表達miRNAs可能發揮著對細胞分化的調節作用。

另外，miR-3065、miR-452等影響蛋白活性、蛋白結合等，調節細胞壽命和細胞凋亡，這可能是SCAPs表達更高水平抗細胞凋亡蛋白的原因所在，但miRNAs是如何調控這些蛋白的機制尚不清楚。miR-224被證實能夠通過DMRT1調控干細胞的自我更新進程，Wnt／β信號通路參與，細胞不斷增殖代替死亡細胞，保持干細胞數量不降低［11］。這與本研究中的靶基因功能預測分析相符，可能是SCAPs維持其干性狀態的另一可能機制。

大量研究證實，差異表達miRNAs調控著各類癌癥的發生［12－14］。本研究顯示，miRNAs調控包括mTOR信號通路的多種癌癥通路，參與癌癥的生長和代謝。在 SCAPs中，差異 miRNAs的表達可能使SCAPs的mTOR或其他信號通路活躍，調控細胞周期，使SCAPs獲得更強的增殖能力，這種推論有待進一步證實。

本研究深入地探討了DPSCs與SCAPs不同干性狀態維持的可能機制，結果中miR-224下調顯著，且在干細胞中作用的研究甚少，其機制需進一步驗證。miRNAs在DPSCs和SCAPs中的研究，為牙齒組織工程和牙髓組織再生中的作用機制探索了新的方向。

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