蒺藜苜蓿SBP—box轉錄因子基因家族全基因組分析

李月穎 李菁 劉長寧

摘 要 從全基因組水平研究蒺藜苜蓿SBP-box轉錄因子基因家族，系統地鑒定出22個SBP-box家族基因，根據基因結構分析、結構域的差異和系統發育分析將這些SBP-box基因分成5個亞家族.基因比較分析表明SBP-box基因家族擴張主要是通過部分復制及串聯重復事件來實現的.基因表達模式分析表明蒺藜苜蓿SBP-box基因具有器官特異性并且參與干旱脅迫反應.這些結果為進一步研究蒺藜苜蓿SBP-box 家族基因的功能與進化提供理論參考.

關鍵詞 SBP-box轉錄因子；進化分析；基因表達模式；蒺藜苜蓿

中圖分類號 Q349+.13文獻標識碼 A文章編號 1000-2537（2017）06-0024-10

Abstract This study conducted a genome-wide investigation of the SBP-box gene family in Medicago truncatula. A total of 22 SBP-box genes were systematically identified from Medicago truncatula and classified into 5 subfamilies according to the gene structure analysis， motif analysis and phylogeny relationship. Further genome comparison analysis revealed that segmental duplication and tandem duplication were two important ways for SBP-box genes to extend in the Medicago truncatula genome. Results from expression profile analysis revealed that SBP-box genes have the organ-specificity and were involved in drought stress responses. The data presented here should provide a theoretical foundation for verifying the function and evolution of SBP-box genes in Medicago truncatula.

Key words SBP-box transcription factors； phylogeny analysis； gene expression patterns； Medicago truncatula

轉錄因子（Transcription Factors）也稱反式作用因子，是指能夠與真核基因啟動子區域中順式作用元件發生特異性相互作用的DNA結合蛋白.它們通過彼此之間以及與其他相關蛋白之間的相互作用，參與決定基因在何種組織與何種發育階段開始轉錄，或者參與基因應答外界環境因素所導致的轉錄，在調節植物防衛病原微生物和響應外界環境脅迫中發揮重要作用[1].SBP-box基因家族編碼的SBP轉錄因子是植物所特有的一類轉錄因子.這些基因都有編碼DNA結合結構域的保守核苷酸序列，又稱為SBP盒（SBP-box）基因.SBP-box基因首先是在金魚草（Antirrhinum majus）中識別并結合MADS-box基因SQUAMOSA啟動子的一個體外實驗中被發現而得到確認的[2].自此之后，SBP-box基因在擬南芥、玉米、白樺等植物中相繼被分離出來[3-5]，并且對其功能進行了很多研究.

Birkenbihl等[6]在擬南芥中發現了16個SBP-box基因，將它們命名為SPL1-SPL16.這些基因編碼的蛋白質能夠特異結合在AP1基因（SQUAMOSA在擬南芥中的同源基因）的啟動子區段.SPL3和SPL8在擬南芥中能夠分別影響植株的成花轉變和花粉囊的發育[7]；SPL5和SPL15兩個基因能夠控制擬南芥的生殖生長；SPL14是該基因家族中序列最長的基因之一，近來被認為參與受到真菌毒素FB1誘導的細胞程序性死亡的過程[8]；AtSPL2在擬南芥AtJMT超量表達植株中響應茉莉酸甲酯介導的抗病途徑[9].玉米中LIGULELESS1（LG1）基因缺失突變體的葉耳和葉舌不能形成[4].Wang等[10]發現在TGA1基因的啟動子和編碼序列中幾個核苷酸的改變與玉米花序結構有關. 2015年Tan等和2016年Song等的研究也分別表明白菜和菊花中的SBP基因具有響應激素處理及非生物脅迫的功能[11-12].

SBP蛋白雖然在一級結構上很多樣化，但是它們都有一個高度保守的DNA結合結構域（全稱DBD），該區域有約76個氨基酸殘基長，即SBP結構域.這一結構域包括兩個典型的C3H和C2HC型的鋅指結構（Zn-finger structure）[13]和C末端的一段高度保守的雙向核定位信號（Nuclear Localization Signal，NLS）[6].Zn2+和核定位信號在蛋白與DNA結合過程中是必需的，C端的NLS與C2HC型鋅指結構序列部分重疊，具有引導SBP-box基因進入細胞核從而對其下游基因的轉錄表達進行調控的功能.另外，現在發現的SBP基因中，有一部分還擁有高度保守的miR156/miR157識別位點[14].

豆科（Leguminosae）是種子植物第三大科，是人類及動物獲取食物和營養來源的重要科屬之一[15].蒺藜苜蓿是豆科苜蓿屬一年生植物，由于其具有生育期短、二倍體、自花授粉、基因組較小且遺傳轉化效率高等特點被作為豆科基因組學和生物學的模式植物進行研究[16].蒺藜苜蓿全基因組測序已經完成，使得利用生物信息學手段研究該物種基因家族系統演化及功能成為可能.截至目前，在全基因組水平對蒺藜苜蓿SBP-box基因家族的研究尚未見報道.本研究利用生物信息學手段，從全基因組水平篩選和鑒定蒺藜苜蓿SBP-box基因，并利用生物信息及系統發育分析方法進行比較基因組學研究，以探究蒺藜苜蓿SBP-box基因家族系統進化關系、基因結構及保守基序的差異和變化以及基因家族的復制特點；同時基于對基因家族的進化分析，結合表達譜的數據對蒺藜苜蓿SBP-box家族基因功能進行深入研究，以期闡明蒺藜苜蓿SBP-box家族基因在生長、發育及防御等方面的生物學功能，從而為豆科基因資源的開發和利用提供理論基礎，實現豆科經濟作物中重要基因的克隆及功能研究并為豆科育種的快速發展和其他遺傳研究提供現實可行的依據.

1 材料方法

1.1 數據來源

本研究蒺藜苜蓿蛋白質數據，編碼序列數據以及全基因組數據下載于JCVI數據庫（Mtruncatula_198；http：//ftp.jpi-psf.org/pub/compgen/phytozome/v9.0/Mtruncatula）[17]；擬南芥SBP-box家族蛋白序列和基因序列下載于擬南芥全基因組數據庫（TAIR 9.0，http：//www.arabidopsis.org/）[18]；蒺藜苜?；蛐酒磉_數據來自諾貝爾基金會蒺藜苜?；虮磉_圖譜數據庫（http：//mtgea.noble.org/v3/）[19-20].

1.2 蒺藜苜蓿SBP-box家族成員鑒定

擬南芥的SBP-box家族成員共17個蛋白序列作為query sequence執行本地BLASTP[21]（e-value設置為1×10-5）搜索蒺藜苜蓿的蛋白序列；同時在Pfam數據庫（http：//pfam.sanger.ac.uk/search）中下載了SBP-box結構域的HMM文件（PF03110），利用HMMER （v3.1b2，http：//hmmer. org）構建隱馬爾科夫模型（Hidden Markov Model，HMM，）在蒺藜苜蓿蛋白數據庫搜索含有SBP-box結構域的候選序列（E-value設為1）.將第一步和第二步的結果合并并且去冗余，去冗余后假定的蒺藜苜蓿的蛋白序列放到SMART[22]（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和NCBI Conserved Domains[23]（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）在線工具中進一步檢查是否具有SBP結構域，手工去除冗余和不完整讀碼框的序列，最終得到蒺藜苜蓿的SBP-box基因.利用 ExPASy Proteomics Server[24]（http：//prosite.expasy.org/）對所有蒺藜苜蓿SBP-box蛋白氨基酸序列進行相對分子質量、等電點預測.利用softberry （http：// linux1.softberry.com/berry.phtml）中的The ProtComp 9.0 進行SBP-box蛋白的亞細胞定位預測.

1.3 SBP家族系統發育樹構建

利用ClustalX （v2.1）[25]對擬南芥和蒺藜苜蓿SBP蛋白進行多序列聯配比對分析，比對結果使用 MEGA[26]（v6.0）進行系統進化分析.發育樹構建采用鄰接法（The Neighbour Joining，NJ），檢驗參數Boot-strapping重復1 000次.

1.4 蒺藜苜蓿SBP-box基因結構分析以及SBP-box蛋白保守功能基序預測

利用在線工具 Gene Structure Display Server（GSDS； v2.0； http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）[27]分析SBP-box家族基因結構.在線工具Motif Elicitation tool（MEME； v4.11.2； http：//meme-suite.org/tools/meme）[28]可以很好地分析基因的基序.本研究將蒺藜苜蓿SBP-box蛋白序列提交到MEME網站預測SBP-box基因的基序.預測基序的數量為10；基序的長度為20～200；基序重復的數量為“any”.

1.5 蒺藜苜蓿SBP-box家族染色體定位及復制分析

利用Phytozome植物全基因組數據庫（http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）[29]確定SBP-box基因在染色體上的位置，并使用MapInspect工具（http：//www.plantbreeding.wur.nl/uk/software_mapinspect.html）標出每個蒺藜苜蓿SBP-box基因在染色體組上的位置，從而得到每個SBP-box基因在基因組中的分布情況.利用MCScanx[30]進行基因家族的復制分析.判定基因復制事件的條件基于植物基因組復制數據庫（the Plant Genome Duplication Database）[31]的鑒定方法即基因重復事件必須同時滿足以下條件[32]：（1）兩個基因序列相互匹配部分的長度大于較長序列長度的80%；（2）兩個基因序列相互匹配部分的相似性大于80%；（3）緊密相連的基因中，只參與一次復制事件.同時結合基因在染色體上的位置，判斷發生了串聯復制還是片段復制.

1.6 蒺藜苜蓿SBP-box基因家族表達模式分析

根據蒺藜苜蓿SBP-box基因對應的CDS序列，在蒺藜苜?；蛐酒脚_BLAST搜索其對應的探針，探針的表達量數據包括蒺藜苜蓿的根部（root）、葉柄（petiole）、芽（bud）、莖（stem）、花（flower）、果莢（pod）、種子（seed）的不同發育階段，以及根和莖中SBP-box基因在干旱脅迫下的表達量.通過R軟件對SBP-box基因的表達數據進行正則化并運用Pheatmap程序包對正則化的蒺藜苜蓿SBP-box基因表達數據進行聚類分析.

2 結果與分析

2.1 蒺藜苜蓿SBP-box 基因家族的鑒定以及蛋白質的理化性質分析

為了鑒定蒺藜苜蓿SBP-box基因家族，同時使用BLASTP以及HMM搜索蒺藜苜蓿中的蛋白序列來找出包含SBP-box結構域的蛋白.為了進一步確定結果的可靠性，使用SMART和NCBI Conserved Domains檢驗SBP-box結構域的存在，刪除不具有SBP-box保守結構域的序列.最后在蒺藜苜蓿中共鑒定出23個SBP-box蛋白，這些蛋白隸屬22個基因，使用物種名的縮寫作為前綴，給每一個SBP-box蛋白命名.系統性地評估了這些SBP-box蛋白的基本性質，包括預測蛋白質的長度、相對分子質量、等電點以及亞細胞定位.這些SBP-box蛋白序列的長度為144到1 026個氨基酸殘基；利用在線工具ExPASy對蒺藜苜蓿SBP-box蛋白質相對分子質量、理論等電點系數進行分析發現，23個SBP-box中07D（MtSBP3）相對分子質量最大，為112 971；最小的61D（MtSBP5）為16 950；這些基因的理論等電點變異相對較小，從5.4（MtSBP2B）到9.2（MtSBP6）不等；利用在線工具softberry進行蛋白質的亞細胞定位預測與它的轉錄因子家族的角色相對應，有13個SBP-box定位到細胞核上（表 1）.

2.2 蒺藜苜蓿SBP-box基因家族的進化分析

為了解蒺藜苜蓿SBP-box基因家族成員的系統進化關系，利用蒺藜苜蓿SBP-box蛋白保守結構域構建系統進化樹，包括22個蒺藜苜蓿SBP-box蛋白以及17個擬南芥SBP-box蛋白，系統進化分析將這些SBP-box蛋白分為5個亞家族，命名為A，B，C，D以及E（圖 1）.5個亞家族又可以分為兩類，相較于亞家族A，B，C和E，亞家族D的蛋白包含了相對較長的氨基酸序列，這說明這兩類之間可能存在一些功能差異性.亞家族 D包含4個蒺藜苜蓿SBP-box蛋白以及4個擬南芥的SBP-box蛋白，其中AtSPL14以及AtSPL16分別為SPL1-Related2 protein （SPL1R2）以及SPL1-Related3 protein（SPL1R3），所以與AtSPL1具有更近的親緣關系.亞家族A，B，C和E包含19個蒺藜苜蓿SBP-box蛋白以及13個擬南芥SBP-box蛋白，亞家族A，B及C均同時含有蒺藜苜蓿和擬南芥的SBP-box蛋白，亞家族E只含有3個擬南芥的SBP-box蛋白.

2.3 蒺藜苜蓿SBP-box基因家族基因結構以及蛋白質保守基序分析

內含子外顯子結構和內含子類型與數量是一個基因家族典型的進化印跡.進一步探究蒺藜苜蓿SBP-box基因家族的22條序列以及擬南芥中SBP-box基因家族17條序列的基因結構，發現系統進化樹同一分枝的基因結構比較相似而不同分枝之間的基因結構有所差異.蒺藜苜蓿SBP-box轉錄因子基因家族的內含子數目為1～10不等（圖 2）.通過統計發現，在蒺藜苜蓿中，有4個蒺藜苜蓿SBP-box基因家族成員含有1個內含子（比例18.1%）；5個蒺藜苜蓿SBP-box基因家族成員含有2個內含子（比例22.7%）；7個蒺藜苜蓿SBP-box基因家族成員含有3個內含子（比例31.8%）；2個蒺藜苜蓿SBP-box基因家族成員含有4個內含子（比例9.09%）；還有4個蒺藜苜蓿SBP-box基因家族成員含有8個以上的內含子（比例18.1%）.進一步分析發現，亞家族D的蒺藜苜蓿SBP-box基因家族成員內含子數目大于亞家族A，B，C及E分支，且外顯子-內含子結構相似，基因結構比較復雜，MtSBP4含有8個內含子，其余基因含有9個內含子.相反的，A，B，C及E亞家族含有較少的內含子，除了AtSPL7含有9個內含子外，其余的基因僅有1～4個內含子.使用MEME分析工具對所有的蒺藜苜蓿SBP-box蛋白序列進行預測，結果顯示10個保守功能基序都具有統計顯著性，每個保守基序的e-value都小于1e-300（圖3）.蒺藜苜蓿SBP-box基因保守基序的預測大部分支持SBP-box轉錄因子基因家族系統發育分析的分類.這些保守基序的序列特征以及氨基酸長度如圖3所示.其中motif2，motif1以及motif4是存在于所有蒺藜苜蓿SBP-box蛋白N端的保守SBP結構域，蒺藜苜蓿的每個亞家族中都有一些基序具有亞家族特異性.motif3，motif7，motif8，motif10，motif5，motif9以及motif6是亞家族D中特有的基序，亞家族D中的蒺藜苜蓿SBP-box蛋白與AtSPL14（SPL1-Related2 protein （SPL1R2）），AtSPL1及AtSPL12比較相似，AtSPL16缺少motif7.與基因結構相對應，A，B，C和E亞家族含有比較統一且簡單的蛋白保守基序.亞家族特有的基序可能在亞家族的功能特異性中具有重要作用.

2.4 蒺藜苜蓿SBP-box基因家族在染色體上的分布與重復

為了探究蒺藜苜蓿SBP-box基因家族的擴增和進化可能的機制，本研究對蒺藜苜蓿SBP-box基因進行染色體定位分析，通過提取蒺藜苜蓿SBP-box基因的染色體定位信息，得到23個SBP-box基因在蒺藜苜蓿染色體上的定位圖（圖4）.23個SBP-box基因不均勻地分布在7條染色體上，每條染色體分布有1～6個SBP-box基因，其中：8號染色體最多，為6個基因；其次是2號和7號染色體，均為4個基因；5號染色體最少，只有1個基因.使用MapInspect軟件繪制蒺藜苜蓿SBP-box基因在染色體上的分布，同時檢驗SBP-box基因家族的復制事件，蒺藜苜蓿SBP-box基因轉錄因子家族的片段復制和串聯重復的基因對分別使用細線以及黃棕色方框進行標示.利用染色體片段、基因組重復區信息，共發現21對發生片段重復和串聯重復的同源基因（圖4），它們的序列同源性較高，其中19對重復基因對發生片段重復（占所有復制基因對的90.5%），發生片段復制的基因對分布于除亞家族E之外的系統發育分枝的各個亞家族（包括A—D），它們的分布有一定的分支偏好性.大約63.2%（19對片段復制基因中的12對）分布在相同的系統發育亞家族中，這可能是由蒺藜苜?；蚪M的多倍化過程導致；另外兩對基因MtSBP20/MtSBP21和MtSBP21/MtSBP22發生了串聯復制，且這兩對基因均位于亞家族B，串聯重復的基因對具有很高的序列相似性，往往高于60%.

2.5 蒺藜苜蓿SBP-box基因家族的表達分析

本研究收集了蒺藜苜蓿不同組織器官（結節、根、莖、葉、花和豆莢以及種子的不同發育階段）的表達數據.然后使用層次聚類來表現豆科4個物種中的SBP-box基因在不同組織器官的表達模式.如圖5（彩圖見封三）所示，對于蒺藜苜蓿SBP-box基因，它們被聚類為低表達量（MtSBP17，MtSBP13，MtSBP12以及MtSBP21）、表達量有變化（MtSBP8，MtSBP9，MtSBP14，MtSBP2B和MtSBP16）以及高表達量（MtSBP19，MtSBP1，MtSBP2A，MtSBP3和MtSBP4）3種模式，不同組織器官表達量的分析表明大部分蒺藜苜蓿SBP-box基因家族成員的表達不具有組織特異性，在包括組織器官的生長發育以及種子的生長發育中都發揮重要的作用；但部分基因具有組織特異性如MtSBP19在種子發育的不同階段表達量差異很大，MtSBP2B/MtSBP14在豆莢中表達量較高，而MtSBP16在根中表達量較高.結合基因復制的結果發現，發生片段復制的基因對，它們傾向于表現出不同的表達模式.在蒺藜苜蓿中總共有19個發生片段復制的基因對，本研究收集到7對的表達數據，其中6對表現出不同的表達模式聚類，例如MtSBP9/MtSBP13與MtSBP17/MtSBP19，所有這些結果表明片段復制的基因參與了植物生長發育的不同過程.同時本研究分析了在干旱脅迫2，3，4，7，10以及14 d豆科SBP-box基因在根和莖中的的表達量變化，通過繪制熱圖發現，莖中MtSBP9對干旱有顯著響應.根中MtSBP2B以及MtSBP16對干旱也有顯著響應，表明多個SBP-box基因參與了逆境脅迫應答.

3 討論

SBP-box基因是在研究花形成路徑的基因調控網絡中發現的，因此被認為和花的發育密切相關，在近幾年的研究中發現SBP-box基因有著廣泛的生物學功能[33-34].隨著基因組測序的發展，SBP-box基因的功能在各種植物中被研究.然而，SBP-box基因在蒺藜苜蓿中的功能至今仍不清楚.本研究運用生物信息學手段，采用結構域搜索的方法，利用已知基因所編碼蛋白質中的結構域為檢索序列，對蒺藜苜蓿SBP-box基因家族全基因組進行分析，共鑒定出22個蒺藜苜蓿SBP-box基因家族基因，這些基因編碼的蛋白質序列中均包含高度保守的SBP結構域.蒺藜苜蓿SBP-box家族成員多于在擬南芥和水稻基因組中鑒定出的17和19個基因[35-36].

通過序列比對和系統進化方法，確定了蒺藜苜蓿SBP-box基因家族的分類和進化關系.根據系統發生樹將SBP-box基因家族分成了5個亞家族.通過系統進化樹分析得出， SBP-box基因在進化上表現出差異性，暗示其基因功能的多樣性；同時每一亞家族的基因間保守性基序的結構和順序相似，表明同一亞家族中的基因可能具有類似的功能.外顯子內含子結構分析表明，處在相同亞家族內的蒺藜苜蓿SBP-box基因大部分具有相同的外顯子內含子結構.SBP-box結構域的進化可能與基因結構的多樣化有關.蒺藜苜蓿中所有的SBP蛋白都具有完整且高度保守的SBP區（即兩個鋅指結構和一個雙向核定位信號）；在擬南芥及蒺藜苜蓿中序列較長的SBP蛋白，尤其是超過1 000個氨基酸殘基的SBP蛋白，除了保守的SBP結構域還含有一些其他的區域，如亞家族D中的家族成員，這些區域可以促進SBP蛋白進入核內，進一步通過翻譯后修飾而被調控，從而影響它進入核的水平和與DNA結合的水平[6]，進一步影響基因在不同生物過程的表達水平.同源性分析是一種相對快速有效了解基因結構、功能和進化的方法[37].因此，蒺藜苜蓿SBP基因的功能可以通過與研究相對通透的模式植物擬南芥進行同源性分析而推測得到.分布在同一亞家族的蒺藜苜蓿以及擬南芥SBP-box基因家族成員可能具有相同的功能.但這些基因的功能需要進一步的試驗驗證.

基因復制對基因家族的進化具有重要的意義，主要是因為基因復制可為新基因的產生提供最原始的材料，而新基因的產生則促使其產生新的功能[38].植物基因的復制主要有3種方式：片段復制、串聯復制、轉座事件如逆轉錄轉座和重復轉錄等.片段復制是最主要的方式，因為大部分植物經歷了染色體加倍過程，并在基因組中保留了大量重復的染色體片段[39].本研究分析發現蒺藜苜蓿的SBP-box基因家族主要是通過片段復制進行擴張.之前的研究表明SPL4/SPL5，SPL9/SPL15以及SPL1/SPL12很可能是通過基因組水平重復而產生[40]，在本研究中，它們分別分布于亞家族E，C以及D；同時SPL4/SPL5，SPL9/SPL15很可能于蕓薹屬（Brassica）植物分化之前就已經存在，所以本研究推測亞家族E和C中的蒺藜苜蓿SBP-box基因家族成員存在較早；擬南芥中SPL10/SPL11具有相同的基因結構，且序列高度相似（82.1%），在染色體上彼此相鄰，它們可能是通過串聯重復機制產生，對應的蒺藜苜蓿中發生串聯復制的SBP-box家族成員MtSBP20/MtSBP21以及MtSBP21/MtSBP22也分布在亞家族B中，且具有較高的同源性.擬南芥中SPL01/SPL12，AtSPL14（SPL1-Related2 protein （SPL1R2）），AtSPL16（SPL1-Related3 protein （SPL1R3））和蒺藜苜蓿中的4個家族成員MtSBP1，MtSBP2A，MtSBP3以及MtSBP4構成了亞家族D，這個家族的基因結構比較復雜并且含有除了SBP保守結構域之外的其他的保守基序，這可能為這一家族適應新的功能和進化提供了條件.

本研究利用生物信息學方法進行組織特異性表達模式分析，發現蒺藜苜?；蚪M中重復的基因發生了功能分歧.本研究收集到7對發生片段復制的蒺藜苜蓿SBP-box基因家族成員的表達數據，其中6對表現出不同的表達模式聚類，所有這些結果表明片段復制的基因參與了植物生長發育的不同過程.亞家族D中發生復制的基因對MtSBP1/MtSBP2A具有共同的表達模式，這種表達模式可能意味著其中一個基因的表達已經不占主導地位，或者是生物界常見的冗余現象.也有復制基因對具有不同的表達模式，如位于亞家族A中的MtSBP13以及亞家族B中的MtSBP14，可能意味著基因家族成員正在不斷分化.

本研究揭示了蒺藜苜蓿SBP-box基因家族的起源、擴增與進化及可能的功能分化，為后續深入探究蒺藜苜蓿SBP-box基因家族的生物學功能提供了理論參考，并為豆科育種和其他遺傳研究提供相關依據.相信隨著基因組和轉錄組數據的積累，對于蒺藜苜蓿SBP-box基因家族的了解將會越來越全面和深入.

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