大孢粘球菌抗腫瘤活性蛋白WGF5分離方法的優化與活性分析

魏慧 黃海燕 于芳楠 劉熊 丁學知 夏立秋

摘 要 為從Myxococcus macrosporus STXZ54發酵液中高效地分離純化出抗腫瘤活性蛋白WGF5，收集STXZ54發酵上清液，先后利用優化后的硫酸銨沉淀方法沉淀蛋白，強陽離子交換、分子篩色譜分離等方法對蛋白粗提物進行精細分離.利用CCK-8試劑盒，倒置顯微鏡、掃描電子顯微鏡等觀察WGF5對腫瘤細胞形態的影響，臺盼藍染色進一步檢測WGF5對腫瘤細胞的毒力.實驗結果觀察到WGF5能夠顯著改變腫瘤細胞形態，與原分離體系相比較，優化后的抗腫瘤活性蛋白分離方法更為高效，簡便易行.

關鍵詞 大孢粘球菌；抗腫瘤活性蛋白；方法優化

中圖分類號 Q936文獻標識碼 A文章編號 1000-2537（2017）06-0044-05

Abstract The anti-tumor active protein WGF5 was isolated and purified from Myxococcus macrosporus STXZ54 fermentation broth by method optimization. Collected supernatant of STXZ54 and the protein WGF5 was separated by the optimized method of precipitating protein， including strong cation exchange and molecular sieve chromatography.The effect of WGF5 on the morphology of tumor cells was further examined by CCK-8 kit， inverted microscope， scanning electron microscope， and trypan blue staining.Our experimental results showed that WGF5 significantly affected tumor cell morphology， compared with the original separation system，our present optimized anti-tumor activity protein separation method is not only more efficient but also simpler.

Key words Myxococcus macrosporus； antitumor activity， separation method optimization

粘細菌（Myxobacteria）是一類具有獨特復雜細胞行為的革蘭氏陰性桿狀細菌，在自然界中廣泛存在于土壤、腐枝枯葉，甚至極端環境中[1].粘細菌在其生命活動中可以產生具有多種生物活性的次級代謝產物和衍生物[2-5]，具有抗菌、抗腫瘤等重要功能[6-12]，成為發現新型藥物前體分子的重要資源.文也等[13]先后利用40%～75%硫酸銨分級沉淀方法分離發酵上清液中的蛋白質組分，弱陽離子交換色譜分離方法、分子篩色譜方法、反相色譜分離方法相結合從大孢粘球菌STXZ54中分離純化出了單一的蛋白類活性物質WGF5.其相對分子質量大小為20 000，在常溫下性質穩定，能夠高效地抑制 B16，Hela，HCT-116，4T1及Hep-3b等多種腫瘤細胞的生長，屬于高效廣譜的抗腫瘤蛋白類活性物質.本研究通過全面優化WGF5的純化方法，探究出更適合蛋白粗分離的硫酸銨梯度沉淀方法，以獲得更多的目的蛋白.用強陽離子交換色譜柱代替弱陽離子交換柱，同時改變分子篩色譜的柱型與分離方法，快速高效地從大孢粘球菌STXZ54中分離得到WGF5，為該物質的大量制備提供更便捷有效的方法.冷場掃描電鏡、臺盼藍染色等進一步分析了WGF5對腫瘤細胞的毒力，為其研發與應用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 Myxococcus macrosporus STXZ54，由本實驗室分離純化并鑒定的新菌株，菌種保藏號（CCTCC NO： M2014455）.

1.1.2 供試細胞株 小鼠黑色素瘤細胞（Murine Melanoma B16 cells）.

1.1.3 培養基

（1）Wax固體培養基：CaCl2·2H2O 1 g，HEPES 0.5 g，瓊脂粉15 g，水1 000 mL，pH 7.2；

（2）CTT固體培養基：酪蛋白胨 10 g，MgSO4·7H2O 8 mmol/L，磷酸鉀緩沖液（pH7.6） 1 mmol/L，Tris-HCl緩沖液（pH7.6） 10 mmol/L，瓊脂糖15 g，pH7.6；

（3）MD1液體培養基：酪蛋白6 g，可溶性淀粉 2 g，MgSO4·7H2O 2 g，CaCl2·2H2O 0.4 g，水1 000 mL，pH 7.2.

1.1.4 試劑與儀器 甲醇、乙腈、硫酸銨、AKTA蛋白純化系統、酶標儀、生物安全柜、冷場掃描電子顯微鏡.

1.2 菌體的發酵培養

將本實驗保藏的實驗菌株Myxococcus macrosporus STXZ54 先接種到CTT固體培養基上培養3 d，再從平板上轉接至1.5 mL EP管中30 ℃培養活化2 d后，轉接到20 mL小瓶MD1液體培養基中擴大培養，按2.5%的比例接種到2 L大搖瓶中，30 ℃，160 r/min培養6 d，10 000 r/min離心20 min，收集發酵上清液.

1.3 CCK-8法檢測細胞毒性

在96孔板中鋪入B16細胞，103個/孔，CO2細胞培養箱，37 ℃溫度環境中培養12 h.實驗組加入待測樣品，對照組加入等體積的PBS，持續在細胞培養箱中培養24 h.在黑暗環境下，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，CO2培養箱中繼續孵育1～2 h，用酶標儀測定各孔吸光值，計算相應的細胞抑制率.

1.4 抗腫瘤活性物質分離體系的優化

1.4.1 硫酸銨沉淀蛋白方法的優化 STXZ54發酵6 d后，收集發酵上清液1 L，分成體積相等的四等分于4組大燒杯中.在第一組發酵上清液中緩慢加入硫酸銨至濃度35%；在第二組發酵上清液中分別加入硫酸銨至35%和70%飽和度分級沉淀蛋白；在第三組發酵上清液中分別加入硫酸銨至70%和100%飽和度；在第四組發酵上清液中分別加入硫酸銨至40%和75%飽和度（文也等[13]所使用的硫酸銨分級沉淀濃度梯度）.12 000 r/min收集各組段沉淀的蛋白，經透析袋（MWCO 7 000～13 000）透析脫鹽，13 000 r/min離心 5 min 收集上清液.過濾除菌后，對各樣品的細胞毒性進行實驗比較.取上清液 20 μL SDS-PAGE 檢測蛋白成分.

1.4.2 高效液相色譜精細分離體系的優化

（1）強陽離子交換色譜分離 配制pH 5.0的 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（A相）和pH5.0的 0.5 mol/L的NaCl溶液（B相）.選擇強陽離子色譜柱SPFF色譜柱對粗體蛋白進行AKTA蛋白純化系統分離.用A相先進行4個柱體積的上樣掛柱，B相進行色譜峰的洗脫，洗脫時，B相起始濃度為0%，在20個柱體積內濃度線性增大到100%.流速0.5 mL/min，檢測波長254 nm.收集各個色譜峰，以備細胞毒性檢測.

（2）分子篩色譜分離 將強陽離子交換色譜分離出的活性峰進行細胞實驗后，選擇有活性的色譜峰進行分子篩色譜分離.色譜柱為Sephadex 200 10/300，流動相為ddH2O，流速0.8 mL/min，檢測波長：215 nm.收集每個色譜峰，冷凍濃縮后進行細胞毒性實驗.

（3）SDS-PAGE檢測分離活性組分的純度 將收集到的樣品冷凍濃縮后，以12%膠濃度進行SDS-PAGE檢測，觀察有無WGF5條帶.

1.4.3 掃描電子顯微鏡觀察對腫瘤細胞形態的觀察 用鑷子將75%乙醇浸泡的蓋玻片（22 mm×22 mm）在酒精燈上烤干，放置于六孔板中，加入2 mL B16細胞，104～105個/孔，5%CO2細胞培養箱中37 ℃培養12 h，加入SCM3，繼續培養24 h，吸去上清，PBS清洗2次，用2.5%戊二醛溶液固定過夜，PBS緩沖液洗滌細胞2～3次，依次用濃度30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%的乙醇溶液逐步給腫瘤細胞脫水.取下蓋玻片，進行掃描電鏡觀察.

1.4.4 臺盼藍染色分析WGF5對SMMC-7721的毒力 將在六孔板接種的細胞置于細胞培養箱培養12 h，實驗組加入10 mg/L WGF5，而對照組加入相同體積的PBS，實驗組和對照組都做相同時間梯度：0，24，36，48，60 h.收集細胞PBS洗滌2次后，80 μL無菌去離子水重懸細胞，然后加入80 μL臺盼藍染色液常溫染色5 min，細胞用血球計數板進行計數，計算細胞的死亡率.

2 結果與分析

2.1 硫酸銨分級沉淀抗腫瘤活性蛋白

利用硫酸銨分級沉淀梯度分別為0%～35%，35%～70%，70%～100%，40%～75%分級沉淀出的4組蛋白，作用B16 腫瘤細胞 24 h，CCK-8試劑盒測定各組樣品的腫瘤細胞抑制率.實驗結果如圖1-a所示，各飽和度下沉淀的蛋白均對兩種腫瘤細胞具有細胞毒性，且 35%～70%飽和度區沉淀出蛋白的細胞毒性為83%，顯著高于其他三組蛋白的抗腫瘤活性.硫酸銨分級沉淀濃度為40%～75%時（原方法所使用的硫酸銨分級沉淀濃度梯度），其沉淀出的蛋白細胞毒性在73%左右.SDS-PAGE檢測硫酸銨分級沉淀梯度分別為35%～70%（圖1-b，泳道1）、40%～75%（圖1-b，泳道2）沉淀出的兩組樣品的蛋白條帶發現，二者蛋白成分相近，且35%～70%硫酸銨分級沉淀出的蛋白中WGF5含量較高.因此，考慮選用35%～70%硫酸銨梯度沉淀法沉淀抗腫瘤活性蛋白.

2.2 強陽離子交換色譜分離抗腫瘤活性蛋白

將提取的抗腫瘤活性粗提蛋白用強陽離子交換色譜進行分離，分離結果如圖2-a所示，圖中出現兩個色譜峰，穿透峰（峰A）在色譜程序開始后不久就被洗脫下來，峰面積較大，最高點接近3 500 mAU.緊隨峰A被洗脫下來的色譜峰（峰B），保留時間為6.5 min.收集各峰進行細胞毒性實驗，并對A和B兩活性峰進行SDS-PAGE檢測，結果表明WGF5在峰B中.大量收集活性峰B，進行下一步分離純化.

2.3 分子篩色譜分離抗腫瘤活性蛋白

收集強陽離子交換色譜分離的活性峰進行分子篩色譜.分離結果如圖3所示，從圖3中可以看出，活性粗提物的分子篩色譜分離共出現了3個峰，其中峰A的色譜峰面積最大，其余2個活性峰的峰面積較小.收集這3個色譜峰進行腫瘤活性實驗，結果發現只有峰C的洗脫液有抗腫瘤活性.

2.4 抗腫瘤活性蛋白的純度檢測

將分子篩色譜分離出的活性峰組分，進行12%SDS-PAGE.檢測結果如圖4所示，泳道1所示只有一個條帶，相對分子質量約20 000，確定為目的條帶WGF5.

2.5 臺盼藍染色觀察WGF5對B16細胞的毒性作用

用4%臺盼藍染色液對WGF5作用不同時間的B16細胞進行染色.早期凋亡的細胞及未死亡的細胞中細胞膜結構較完整，不易被臺盼藍染液染成藍色，從而可以通過這種染色手段將活細胞與死細胞區分開來.從圖5可以看出，隨作用細胞的時間增大，被染色的死細胞數目比例逐漸增加.在WGF5作用48 h后，細胞死亡比例達到了67%，而之前CCK-8試劑盒測得細胞死亡率在67%之上，可以分析得出在CS3作用細胞期間，細胞可能發生了早期凋亡.

2.6 掃描電子顯微鏡觀察細胞形態變化

掃描電子顯微鏡觀察WGF5對B16細胞形態的影響，結果如圖6所示，在對照組中， B16細胞具有明顯的細胞形態變化，細胞形態正常.實驗組中B16細胞的細胞偽足消失，細胞結構坍塌瓦解，細胞變圓死亡，足見WGF5對人臍帶靜脈內皮細胞沒有明顯的毒力.

3 討論

粘細菌是最高級的微生物類群，科研工作者從中挖掘抗腫瘤新藥物的研究體系也日趨完善[14].就目前研究現狀來看，粘細菌抗腫瘤新藥物的開發潛力遠大于放線菌[15].2014年Jansen等從粘細菌Nannocystis pusilla Na a174菌株中分離得到的pyrronazols C1和C2兩種活性物質對多種腫瘤細胞系均有抑制作用，其中對人卵巢癌細胞SK-OV-3的活性最好[16].Tubulysin是具有抗腫瘤細胞活性的多肽類化合物，從Archangium Gephyra中分離獲得，Tubulysin A抑制腫瘤細胞有絲分裂，可以使癌細胞周期被停滯在G2/M并最終走向死亡[17-18].

文也等[13]從Myxococcus macrosporus STXZ54中分離到的WGF5是一種相對分子質量約為20 000的活性蛋白，能很好地抑制B16及Hela等多種腫瘤細胞，在所測試的細胞系中顯示出高效的抗腫瘤活性.但WGF5的分離純化方法較為耗時，步驟略顯繁復，導致WGF5的分離效率較低.本文在文也等[13]研究的基礎上，優化了對Myxococcus macrosporus STXZ54抗腫瘤活性蛋白WGF5的分離純化方法，找到更為適合的硫酸銨分級沉淀蛋白的濃度梯度：35%～70%的硫酸銨梯度下沉淀出的蛋白比原濃度梯度（40%～75%）沉淀出的蛋白表現出更高的抗腫瘤活性，且保留了目的條帶.另外用強陽離子交換柱代替弱陽離子交換柱進行粗提樣品的分離，發現強陽離子交換更易結合STXZ54抗腫瘤活性蛋白組分.同時將色譜柱Sephadex G75更換為Sephadex 200 10/300，其孔徑更適合STXZ54活性蛋白的分離.SDS-PAGE檢測分子篩活性峰，結果顯示為一條帶，大小在20 000左右，即WGF5條帶.優化后的WGF5分離純化方法，省去了反相色譜分離步驟，同時優化了各色譜分離中流動相配方、流速等，進一步提高了WGF5的分離純化效率.

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