抑制PI3K/Akt信號通路對膠質瘤侵襲性及增殖力的影響

張振國　賈麗燕　楊廷艦

【摘要】目的 觀察抑制PI3K/Akt信號通路對膠質瘤侵襲性及增殖力的影響。方法 制備對數生長期的膠質瘤細胞，設置對照組和實驗組，空白對照組不進行藥物處理，普通對照組經過藥物順鉑（DDP）處理，實驗組經過磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抑制劑LY294002（濃度分別調整為

10 umol/L、20 umol/L、40 umol/L）處理。Transwell實驗、MTT法分別檢測LY294002對膠質瘤侵襲性及增殖力的影響。結果 Transwell實驗表明DDP組的侵襲性弱于空白對照組，實驗組（LY294002 10 umol/L）

的侵襲性明顯弱于DDP組（P<0.05）；MTT法檢測表明DDP組細胞相對增殖率小于空白對照組，經LY294002（10 umol/L）處理的實驗組相對增殖率明顯小于DDP組，差異有統計學意義（P<0.05）。

結論 抑制PI3K/Akt信號通路可以減弱膠質瘤的侵襲性及增殖力，為膠質瘤的分子靶向性治療帶來幫助。

【關鍵詞】PI3K/Akt；LY294002；神經膠質瘤；侵襲性；細胞增殖

【中圖分類號】R739.41 【文獻標識碼】B 【文章編號】ISSN.2095-6681.2018.07..03

膠質瘤是最多見的一類腦腫瘤，呈侵襲性生長，病情進展常常累及周圍腦組織，所以單純依靠手術切除無法治愈，5年存活率約為25%～35%[1，2]，同時膠質瘤細胞抵抗射線輻射能力強，所以放射療法對于患者的預后意義不大[3]。隨著在分子生物學領域的研究深入，靶向治療膠質瘤具有重大意義，能夠對腫瘤進行選擇性殺傷[4]。多種因子共同參與致使膠質瘤具有生長侵襲性，其中PI3K/Akt通路激活具有關鍵性作用[5，6]，其可以參與細胞下游信號的激活，調節細胞的轉移、增殖和代謝等 [7]，因此通過研發特異性分子抑制劑對治療膠質瘤意義深遠。本實驗以LY294002抑制PI3K/Akt通路活性，探究膠質瘤侵襲性及增殖力的變化，現對實驗相關信息報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

（1）解凍：購自上海中科院生物學細胞庫的膠質瘤HS683細胞1瓶（1×106 cells/瓶），在37℃的溫水中快速將其溶解；（2）脫壁：適量預溫（37℃）的PBS緩沖液潤洗細胞3次，1 min/次；（3）消化：加入適量0.25%胰蛋白酶溶液，在二氧化碳培養箱（37℃、5% CO2）內消化2分鐘；（4）終止消化：倒置顯微鏡下觀察可見細胞形態收縮變圓并脫落至瓶底，加入6 ml DMEM培養基（含10%胎牛血清）立即終止消化；（5）細胞懸液：無菌吸管由下向上反復輕輕吹打，使其分散離團制成單個細胞懸液；（6）轉移細胞至EP管中調整密度為104/200 μl，并加入0.4%的臺盼藍染色。

1.2 方法

1.2.1 MTT法

（1）微量移液器接種200 μl細胞懸液至96孔細胞板，培養箱（37℃、5% CO2）中孵育24小時；（2）把EP管做好標記并加入適量的無血清培養基，從高到低稀釋藥物濃度，分別向管中加入等量濃度為10 umol/L、20 umol/L、40 umol/L的LY294002，以及濃度為2.5 ug/ml的順鉑，充分混勻，空白對照組不進行藥物處理；（3）以每種藥物、不同濃度重復3個復孔，分別向細胞板孔中加入200 μl無血清培養基，繼續培養6小時；（4）細胞孔內加入20 ml濃度為5 mg/ml的MTT溶液（避光），作用4小時，棄去上清液并加入150 μl的DMSO溶液，藍色結晶溶解后使用酶標儀進行檢測。

1.2.2 Transwell侵襲實驗

（1）將冰存的Matrigel置于-4℃的冰上過夜，用冰預冷的無血清培養基按照1：6稀釋Matrigel至濃度為300 ul/ml，取100 ul稀釋的Matrigel加入上室，均勻涂抹在孔徑為8 um的碳酸酯膜表面，室溫放置3小時，使其聚合成凝膠；（2）向上室加入100 ul細胞懸液，并分別加入100 μl含有不同藥物、不同濃度的培養基，下室加入400 ul含趨化因子的無血清培養基；（3）放入培養箱中培養24小時，無菌棉簽拭去上室碳酸酯膜表面殘存的細胞，PBS緩沖液潤洗2次，1min/次；（4）3%甲醛溶液固定10 min，臺盼藍染色3分鐘，低倍顯微鏡下進行觀察，計數隨機5個視野內的細胞平均數。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行分析，計量資料以“x±s”表示，行t檢驗，計數資以例數（n），百分數（%）表示，行x2檢驗；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組侵襲細胞數比較

與空白對照組比較，DDP對照組膠質瘤細胞的侵襲性減弱（P>0.05），差異無統計學意義（見表1）。

2.3 三組侵襲細胞數比較

與空白對照組、DDP對照組比較，實驗組（LY294002 10 umol/L）膠質瘤細胞的侵襲性明顯減弱，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.4 三組侵襲細胞數比較

與實驗組（LY294002 10 umol/L）比較，實驗組（LY294002 20 umol/L、40 umol/L）膠質瘤細胞的侵襲性減弱，差異無統計學意義（P>0.05）。

2.5 兩組細胞相對增殖率比

與空白對照組、DDP對照組比較，實驗組（LY294002 10 μmol/L）細胞的相對增殖率明顯降低，10 μmol/L、

20 μmol/L、40 μmol/L的LY294002可以使細胞相對增殖率從86.4%降至58.3%、37.9%、20.0%。見圖1。

3 討 論

膠質瘤是惡性程度很高的原發性腦腫瘤，在整個中樞神經系統腫瘤中發病率約占36%～61%[8]。同時腫瘤的臨床表現形式也是多種多樣，其中以占位效應最為突出，系于不斷增大的瘤體以及水腫程度加劇的周圍腦組織對正常腦組織的壓迫所致，顱內壓增高一般會有三種常見的癥狀，諸如：頭痛（最多見）、嘔吐（噴射性）、視物不清等[9]。除此之外，還有部分惡性程度很高的膠質瘤往往發生發展迅速，可在短時間內壓迫正常腦組織并使之移位，有發生腦疝的風險[10]。盡管目前針對膠質瘤治療的手術及化療藥物都不斷得到改進，但療效一般，其中位生存期只有1年左右[11]?；颊呓邮艹Ｒ幨中g治療后容易再次復發的一個重要原因就是膠質瘤不斷侵襲轉染周圍正常腦組織[12]，同時射線只能不同程度的殺死惡變細胞，所以療效不理想。

隨著在分子生物學領域不斷取得新的突破性進展，已有研究表明，激活的PI3K/Akt信號通路具有很強的刺激腫瘤生長侵襲的作用。膠質瘤發生演變的早期階段，經歷的主要分子事件即為表皮因子生長受體（EGFR）由于受到多種因素誘導發生的基因突變以及蛋白的過度表達[13]。EGFR與其相應的胞內或膜上配體結合可以激活自身，或由于體內EGFR受環境影響發生基因突變從而導致其處于持續的活化不衰減狀態，這樣會把酪氨酸不斷活化使之在細胞內持續表現為磷酸化形式[14]。EGFR可以通過多種方式調控細胞的生長代謝途徑，導致腫瘤細胞在體內過度增殖[15]，最關鍵的途徑就是通過PI3K增加此信號通路的活性。PI3K作為細胞膜上的第二信使，可以調節多種活性蛋白的表達，發揮調節細胞生長、遷移、代謝等的生理學作用，這極大地提高了膠質瘤的侵襲性及增殖力[16]，因此通過特異性分子抑制劑減弱PI3K/Akt信號通路能夠為廣大膠質瘤患者帶來一絲曙光，為臨床醫師提供更有效的診療方案[17]。

已有研究證實，肺癌、胃癌、胰腺癌、結腸癌等惡性腫瘤患者通過應用LY294002可以明顯提高化療效果，對改善患者預后有很大的幫助，但在膠質瘤治療效果方面的報道仍很罕見，我們的數據表明抑制PI3K/Akt通路在降低腫瘤侵襲能力方面有著積極的作用；有研究發現，化療藥物順鉑聯合LY294002應用組膠質瘤細胞的遷移及增殖力較單純使用順鉑組減弱，差異有統計學意義，抑制濃度俞大抑制效應愈顯著，但結果尚差異無統計學意義；李洋等人研究發現與對照組、DMSO組相比，經過LY294002處理的膠質瘤細胞增殖力明顯降低（10 μmol/L LY294002組相對存活率為55%，20 μmol/L組為30%），實驗同時表明，LY294002組膠質瘤的侵襲能力明顯降低（52±4）%，差異顯著。該實驗同樣發現，DDP組相較于空白組細胞的生長侵襲性也有不同程度的減弱，但結果差異尚無統計學意義，與空白對照組和DDP組相比，實驗組（LY294002 10 μmol/L）細胞的生長侵襲性受到非常大程度抑制，差異有統計學意義。本實驗同之前報道過的相關實驗相比優點在于，研究同樣也表明，隨著抑制劑濃度的增大

（10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L LY294002），細胞的侵襲性以及增殖力會更加減弱，但是，抑制劑的不同濃度對膠質瘤的抑制效應，差異無統計學意義，仍需進行下一步探討研究。

隨著在醫學分子生物學領域不斷取得新的進展，未來科研的重點應放在加快針對此信號通路抑制藥物的研發，這些分子靶向性藥物有望在膠質瘤的治療中發揮更有效的作用，以期取得令人更滿意的臨床效果。

參考文獻

[1] 劉志國，李連陵，王 通.腦膠質瘤細胞、組織中PGAM1 mRNA、蛋白的表達變化及意義[J].山東醫藥，2013，53（2）：56-58.

[2] 0hgaki H，Kleihues P.Epidemiology and etiology of gliomas[J].Acta Neuorpathol，2005，109（1）：93-108.

[3] 曾紀權. HER-2基因和基質金屬蛋白酶-9在大腸癌中的表達和臨床意義[J].實用癌癥雜志，2013，21（3）：254-257.

[4] Butowski NA，Sneed PK，Chang SM.Diagnosis and treatment of recurrent high-grade astrocytoma[J].J Clin Oncol，2006，24（8）：1273-1280.

[5] Zhang JG，Wang JJ，Zhao F，et al.MicroRNA-21（miR-21） represses tumor suppressor PTEN and promotes growth and invasion in non-small cell lung cancer （NSCLC）[J].Clin Clim Acta，2010，411（11-12）：846-852.

[6] Jiang BH，Liu LZ.PI3K/PTEN signaling in angiogenesis and tumorigenesis[J].Adv Cancer Res，2009，102（1）：19-65.

[7] Cully M， You H，Levine AJ，et al.Beyond PTEN mutations：the PI3K pathway as an integrator of multiple inputs during tumorigenesis[J].Nat Rev Cancer，2006，3：184-192.

[8] 王忠誠.神經外科學[M].第二版.武漢；湖北科學技術出版社，2005：512-516.

[9] Das B，Yeger H，Tsuchida R，et al. A hypoxia-driven vascular endothelial growth factor/Flt1 autocrine loop interacts with hypoxiainducible factor-1 alpha through mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathway in neuroblastoma[J].Cancer Res，2015，65（16）：7267-7275.

[10] 韋鵬翔.中國中西醫實用神經外科學[M].2015，北京：中國醫藥科技出版社，2015：501-520.

[11] Habberstad AH， Lind-Landstrom T，Sundstorm S，et al.Primary human glioblastomas-prognostic value of clinical and histopathological parameters[J].Clin Neuropathol，2012，31（5）：361-368.

[12] Cheng YK，Beroukhim R，Levine RL，et al.A mathematical methodology for determining the temporal order of pathway alterations arising during glioma- genesis[J].Plos Comput Biol，2012，8（1）：e1002.

[13] Brandes AA，Franceschi E，Tosoni A，et al.Epidermal growth factor receptor inhibitors in neuro-oncoloy：hopes and disappointments[J].Clin Cancer Res，2008，14（4）：957-960.

[14] Micallef J，Taccone M，Mukherjee J，et al.Epidermal growth factor receptor variant III-induced glioma invasion is mediated through myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate overexpression[J].Cancer Res 2009，69（19）：7548-7556.

[15] Hatanpaa KJ，Burma S，Zhao D，et al.Epidermal growth factor receptor in glioma：signal transduction，neuropathology，imaging，and radioresistance[J].Neoplasis，2010，12（9）：675-684.

[16] Chakravarti A，Zhai G， Suzuki Y， et al.The prognostic significance of phosphatidylinositol 3-kinase pathway activation in human gliomas[J].J Clin Oncol，2004，22（10）：1926-1933.

[17] 董 倫，蒲佩玉，王 虎，等.EGFR反義RNA與p53基因聯合轉導抑制膠質瘤細胞增殖的體外實驗研究[J].中華神經外科雜志，2007，23：678-681.

本文編輯：吳宏艷