HIV相關腦病患者中樞神經系統來源的HIV-1 Tat蛋白對HUVECs活性的影響

鄭文慧 秦澤明 李昕 曹馨月 單曉宇 溫紅玲 王志玉 黃濤 趙麗

250012濟南,山東大學公共衛生學院衛生微生物檢驗學系山東省“十三五”高校重點實驗室 感染性疾病防控重點實驗室(鄭文慧、李昕、曹馨月、單曉宇、溫紅玲、王志玉、趙麗)；250012濟南,山東大學公共衛生學院預防醫學實驗中心(秦澤明)；250014濟南,山東省疾病預防控制中心(黃濤)

HIV相關腦病(HIV-associated dementia,HAD)是艾滋病患者晚期出現的神經系統并發癥,患者血腦屏障(blood brain barrier,BBB)出現不同程度的結構損傷和功能減退,但其機制尚未闡釋清楚。HIV-1 Tat是HIV-1基因編碼的重要調控蛋白,可借助被HIV-1感染的巨噬細胞等多種細胞分泌、釋放到細胞外,借助自身的穿膜功能到達機體多個部位。內皮細胞是組成BBB的重要細胞,其活性對BBB功能尤為重要,本研究表達并純化了HAD患者大腦基底核來源的Tat蛋白,研究了其對人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)活性的影響,以期為HIV-1神經致病機制提供科學依據。

1 材料與方法

HAD患者基底核(basal ganglia,BG)來源的HIV-1基因(pGEX-KG-tat,216 bp)由本室克隆并保存。鎳親和層析柱、凝膠過濾預裝柱(Column Superdex 75 Increase 10/300 GL)和蛋白純化儀(AKTA explorer)為GE公司產品,His-Tag抗體為proteintech公司產品,BCA蛋白濃度測定試劑盒為碧云天生物技術有限公司產品,cck-8為biosharp公司產品,酶標儀(Synergy2)為美國BioTek公司產品,HUVECs為本室保存。

PCR產物純化后和pET-32a載體酶切用T4連接酶22℃連接過夜。將連接產物轉化大腸桿菌DH5-α,用氨芐青霉素篩選,陽性菌落送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.2 Tat蛋白的原核表達及鑒定：構建成功的重組質粒pET-32a-tat轉化BL21(DE3),挑取單菌落接種到含氨芐青霉素的LB培養基中,37℃震蕩培養至吸光度值在0.6～0.8之間,用IPTG 37℃進行誘導。菌液用PBS清洗,3次后用Tris-NaCl(Tris濃度為50 mmol/L,NaCl濃度為300 mmol/L,PH=8.0)重懸,冰上超聲破碎并離心,上清和沉淀經Western blot(WB)鑒定,同時設pET-32a質粒對照和細菌對照。

1.2.3 Tat蛋白的純化、鑒定及定量：冰上超聲破碎,4℃,9 000×離心30 min收集上清,蛋白純化儀進行純化。按照產品說明書處理鎳親和層析柱后上樣,用含 10 mmol/L、200 mmol/L、500 mmol/L 咪唑的Tris-NaCl溶液洗脫,根據吸收峰的位置,收集洗脫液并經SDS-PAGE和WB鑒定。蛋白純度高的洗脫液經超濾離心管濃縮,再經Column Superdex 75 Increase 10/300 GL進一步純化,洗脫液為含1 mmol/L EDTA的Tris-NaCl,SDS-PAGE和WB進行鑒定,濃縮后BCA試劑盒進行蛋白定量。

1.2.4 Tat蛋白對內皮細胞活性的影響：HUVECs常規培養,待細胞鋪滿至90%時,將Tat蛋白加入96 孔板中,濃度依次為 100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml、1 000 ng/ml,每個濃度設5個平行孔,以正常細胞為陰性對照,培養基作為空白對照。36 h后,按cck-8產品說明書操作檢測細胞活性,酶標儀450 nm檢測吸光度()。

2 結果

PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳,在250 bp處出現與預計的第一外顯子基因(216 bp)片段大小相符的條帶。重組質粒pET-32a-tat轉化后的陽性菌經PCR鑒定和測序證實為HIV-1基因。

WB結果顯示,重組質粒 pET-32a-tat轉化 BL21(DE3)后,經IPTG誘導后在相對分子質量15×10處有一條明顯蛋白條帶(見圖1箭頭所示),與目的蛋白大小一致,還有小部分蛋白以多聚體存在,大部分可溶性蛋白在上清中,還有較少部分在包涵體內。上清經鎳親和層析柱純化,500 mmol/L洗脫液中Tat蛋白含量較高,加入DTT后對蛋白多聚體影響較小(見圖2所示)。該峰洗脫液濃縮后經Column Superdex 75 Increase 10/300 GL進一步純化可見單個吸收峰,根據出峰位置可知為一分子量較大的多聚體,純化濃縮后的Tat蛋白在DTT作用下,分解成以單體為主的多種形式(見圖3)。該單峰洗脫液濃縮,測得濃度為0.47 mg/ml。

HUVECs吸光度檢測結果及統計學分析見表1和表2。結果顯示,不同濃度Tat蛋白的實驗組中,HUVECs細胞的均數在組間的差異具有統計學意義(＜0.05)；陰性對照組(0 ng/ml)、100 ng/ml和200 ng/ml實驗組之間均數的差異無統計學意義(＞0.05)；與陰性對照組相比,300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml和1 000 ng/ml組顯著降低,差異有統計學意義(＜0.05),300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml和1 000 ng/ml組之間值的差異無統計學意義(=19.607,=0.000)。隨著Tat蛋白濃度的增加,細胞活性逐漸降低,300 ng/ml組細胞活性下降更明顯(圖4)。

圖1 HIV-1 Tat的表達與鑒定A： SDS-PAGE；B：Western blotM：Protein marker；1：Bacterium control；2：pET-32a plasmid control；3：pET-32a-tat positive bacterium；4：Supernatant；5：PrecipitationFig.1 Expression and identification of HIV-1 Tat

3 討論

圖2 HIV-1 Tat經鎳親和層析柱純化和鑒定A：UV absorption of AKTA explorer；B：SDS-PAGE；C：Western blotM：protein marker；1：Waste liquor；2：Waste liquor with DTT；3：200 mmol/L imidazole eluent；4：200 mmol/L imidazole eluent with DTT；5：500 mmol/L imidazole eluent；6：500 mmol/L imidazole eluent with DTTFig.2 Purification of HIV-1 Tat protein by Ni-chelating chromatography column and identification

表1 不同濃度HUVECs細胞吸光度檢測結果Tab.1 Absorbance of HUVECs in different concentration groups

表2 不同組HUVECs吸光度多重比較方法的結果Tab.2 Absorbance of HUVECs in different groups results of multiple comparisons

Tat蛋白由調控基因tat的兩個獨立外顯子編碼,可劃分為N末端激活區、半胱氨酸富集區、核心區、堿性氨基酸富集區、谷氨酰胺富集區、C-末端區六個功能區。Tat蛋白對BBB相關細胞的作用方式可分為兩種：①直接作用：Tat可與細胞表面受體結合,發揮生物學作用,如堿性氨基酸富集區可介導Tat蛋白與硫酸類肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans,HSPG)結合,使Tat蛋白在細胞外基質富集,Tat蛋白與堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)競爭結合 HSPG,使bFGF濃度增加,從而促進卡波氏肉瘤和內皮細胞增長；也可借助堿性氨基酸富集區的穿膜特性進入細胞,可調控HIV-1基因組表達,并為病毒復制創造適宜環境。還可通過損傷細胞器、上調促凋亡蛋白表達等途徑損傷細胞,影響細胞發揮正常生理作用。②間接作用：通過激活信號通路等途徑,誘導星形膠質細胞產生ROS和促炎癥介質,參與炎癥反應,進而損傷BBB。近些年的研究表明,HIV-1 Tat蛋白可通過損傷BBB相關細胞、調節緊密連接蛋白的表達等途徑損傷BBB的結構,進而影響BBB發揮正常功能。

A：AKTA explorer UV 吸收圖；B：SDS-PAGE；C：Western blot；圖3 Column Superdex 75 Increase 10/300 GL純化的HIV-1 Tat及鑒定A：UV absorption of AKTA explorer；B：SDS-PAGE；C：Western blot；Fig.3 Purification of HIV-1 Tat by Column Superdex 75 Increase 10/300 GL and determination

?與陰性對照組比較,P＜0.05圖4 HIV-1 Tat蛋白對HUVECs細胞活性的影響?P＜0.05 VS negative controlFig.4 The effects of HIV-1 Tat on viability of HUVECs

本課題組前期研究發現,該HAD患者感染的HIV-1為B亞型,其BG來源tat序列與HXB2 tat標準序列間的基因距離差異有統計學意義(＜0.05),而非HAD患者BG來源tat序列與HXB2 tat標準序列間的基因距離差異無統計學意義(＞0.05),HAD患者BG來源的Tat誘導U87細胞分泌的TNF-α和IL-1β比非HAD患者BG來源組高,表明二者生物學活性存在差異。本研究表達了HAD患者BG來源的HIV-1 Tat,并進行純化,研究發現,經鎳親和層析柱純化的Tat蛋白在濃度較低時主要是以單體和二聚體存在,蛋白濃縮后經凝膠過濾預裝柱進一步純化后,得到的UV吸收峰為單峰。在DTT的作用下,多聚體逐漸分解成以單體為主、多種聚合體共同存在,說明Tat多聚體的形成并不完全依靠二硫鍵,其他機制有待進一步研究。

HIV-1進入中樞神經系統首先要通過血腦屏障,血腦屏障維持腦內各種離子、遞質等的動態平衡與BBB的細胞和結構密不可分。血管內皮細胞是血腦屏障最表面的細胞,對維持血腦屏障的通透性具有非常重要的作用,同時,內皮細胞之間形成的緊密連接還可控制細胞旁路的物質轉運。HIV-1感染細胞后,在細胞內增殖,合成病毒蛋白,通過直接感染內皮細胞和破壞緊密連接蛋白損傷血腦屏障。血腦屏障的通透性增強,感染了HIV-1的單核細胞等有害物質可進入中樞神經系統,損傷神經元,進而引起一系列的神經行為障礙?；趦绕ぜ毎贖IV入侵中樞神經系統和HIV神經致病性過程中的重要地位,本文使用內皮細胞進行研究。先前研究血管內皮細胞通常采用原代HUVECs,但其增殖能力低且生命周期有限,本研究采用的HUVECs可穩定傳代,生長良好,易于培養,且保留了原代內皮細胞的特征,可較好的替代原代內皮細胞進行研究。不同濃度的Tat蛋白對HUVECs活性的影響結果顯示,與陰性對照組相比,100 ng/ml和200 ng/ml Tat使HUVECs細胞活性降低,但是差異無統計學意義；隨著Tat蛋白濃度的增加,細胞活性逐漸降低,300 ng/ml組細胞活性下降明顯。與陰性對照組相比,300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml和 1 000 ng/ml四組細胞活性差異均有統計學意義,但是組間差異無統計學意義。不同Tat濃度對HBMECs活性影響的結果可能與 Tat蛋白的作用方式有關,Tat對HUVECs的作用是通過與其表面受體的結合還是進入細胞發揮作用有待于進一步研究。Ma等報道,200 ng/ml Tat蛋白可使人腦微血管內皮細胞(human brain microvascular endothelial cells,HBMECs)活性顯著降低,與本研究的結果略有不同,原因之一可能是HUVECs與HBMECs都有內皮細胞的共性,但在結構和功能仍存在差異,使得不同的內皮細胞對外源性物質的敏感性存在差異。此外,不同亞型的HIV-1 Tat蛋白在與 LTR(long terminal repeat sequence,LTR)結合能力、促進病毒增殖和上調細胞因子、趨化因子輔助受體表達等生物學活性方面存在差異,Tat蛋白的氨基酸位點的變異使其功能和致病機制發生轉變,不同來源的Tat,其氨基酸位點變異不同,這也可能是造成研究結果差異的原因。

本研究優化了Tat蛋白的純化條件、且純化的蛋白具有一定的生物學活性,為進一步研究細胞水平和動物水平Tat蛋白的神經致病機制奠定了基礎。

無