乙型肝炎病毒核苷(酸)類似物多重耐藥宿主免疫因子水平的研究

付麗娟 張怡 張亞男 高巍 陳巖

150036哈爾濱,黑龍江省醫院感染內科(付麗娟高巍 陳巖),檢驗科(張亞男)；150040哈爾濱,黑龍江省中醫藥大學附屬第一醫院外三科(張怡)

固有免疫是是機體抵御病原體入侵和擴散的第一道防線,也是機體免疫防御的基礎。病原體感染機體后,固有免疫首先調動起來抑制病原體的復制,并清除病原體。固有免疫的特點是反應快且具有普遍性。機體的固有免疫系統主要包括：物理和化學的各種屏障,各種細胞如吞噬細胞、釋放炎癥因子的細胞、NK細胞等以及各種細胞因子等[1]。

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染作為世界性的公共衛生難題嚴重危害人類健康。HBV侵入機體后,于肝細胞的細胞核及胞漿中復制、裝配、釋放導致更多細胞感染[2]。同時機體調動固有免疫及特異性免疫應答將病毒清除。目前機體的固有免疫在抗HBV中的作用受到眾多學者關注,但針對核苷(酸)類似物抗HBV治療導致耐藥的慢乙肝患者機體的固有免疫狀態研究較少。核苷(酸)類似物抗HBV耐藥是HBV DNA出現耐藥位點變異,導致核苷(酸)類似物抗病毒療效下降[3]。核苷(酸)類似物耐藥是否會導致宿主的固有免疫狀態發生變化,這種變化是耐藥引起的,還是固有免疫狀態的變化促進了核苷(酸)類似物的耐藥,研究較少。新發現的與抗病毒有關的固有免疫因子IFN-α、IFN-γ、Mov10、TRIM22 的表達有助于機體清除乙肝病毒[4-5],但在長期應用核苷(酸)類似物抗病毒治療導致耐藥的患者中固有免疫因子IFN-α、IFN-γ、Mov10、TRIM22的表達情況尚不明確,是否固有免疫因子 IFN-α、IFN-γ、Mov10,TRIM22 的表達水平與核苷(酸)類似物耐藥機制有關。因此本研究通過檢測核苷(酸)類似物耐藥患者的固有免疫因子IFN-α、IFN-γ、Mov10 和 TRIM22 的 mRNA 表達水平,探討導致核苷(酸)類似物耐藥的宿主固有免疫機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者應用核苷(酸)類似物抗病毒治療出現臨床耐藥患者28例,交叉耐藥患者10例,多重耐藥患者18例,患者來自黑龍江省醫院感染內科2011年12月份至2015年1月份門診及病房就診患者。20例健康對照者來自黑龍江省醫院體檢中心。所有入選患者及健康體檢者均知情同意。(1)入選病例的診斷標準符合2015年版《慢性乙型肝炎防治指南》[6]。(2)既往服用核苷(酸)類似物藥物持續時間≥6個月。(3)核苷(酸)類似物聯合或序貫治療應用藥物種類≥2種。(4)核苷(酸)類似物抗病毒治療出現原發性治療失敗、部分病毒學應答、病毒學突破、生化學突破。(5)分組標準：交叉耐藥(cross resistance)：是指針對一種抗病毒藥物出現耐藥變異對另一種或幾種抗病毒藥物也出現耐藥。多重耐藥(multidrug resistance)：是指耐藥位點不同的藥物進行單藥序貫或聯合治療時,HBV可在不同藥物的靶位上出現耐藥變異,從而產生變異病毒株,且對多種藥物耐藥。對兩種核苷(酸)類似物耐藥的為交叉耐藥組；對兩種以上核苷(酸)類似物耐藥的為多重耐藥組。(6)排除標準：停藥復發患者；同時合并有HCV、HDV、HEV、HIV感染；合并自身免疫性肝病及其他自身免疫性疾??；合并遺傳代謝性肝臟疾??；妊娠或哺乳期婦女；合并嚴重其他系統疾病或精神疾病者。健康對照組(1)既往否認肝臟疾病史(否認乙肝、丙肝、丁肝、酒精肝、自身免疫性肝病史)。(2)生化學正常。(3)乙肝五項檢查結果：HBsAg(-)、HBsAb(+)或(-)；HBeAg(-)、HBeAb(-)、HBcAb(-)。(4)梅毒及 HIV抗體陰性。(5)自身抗體系列：陰性。(6)無長期飲酒史。(7)近6個月未服用過任何藥物。(8)無其他系統性疾病(如腦梗塞、高血壓、糖尿病、腫瘤,自身免疫性疾病等)。

1.2 固有免疫因子mRNA表達水平檢測健康對照組及入選病例組每人均采集靜脈血4ml,EDTA抗凝,人淋巴細胞分離液,按說明書操作分離外周血單個核細胞。Trizol法提取PBMC總RNA。提取得到的RNA質量用紫外分光光度計檢測。SYBR Real-Time PCR檢測試劑盒(TaKaRa公司)；按照試劑盒說明書完成操作。RT-PCR引物序列見表1。

1.3 統計學方法變量不服從正態分布,組間差異比較采用Kruskal-Wallis非參數檢驗方法；變量不服從正態分布,相關分析采用spearman秩相關分析。

表1 相關基因逆轉錄mRNA引物參考序列Tab.1 Reference sequences of the primers for relevant genes reverse transcription mRNA

2 結果

2.1 耐藥組及正常對照組固有免疫因子 IFN-α,Mov10,IFN-γ和TRIM22的mRNA表達耐藥組與正常對照組固有免疫因子 IFN-α、Mov10、IFN-γ和TRIM22的mRNA表達比較,耐藥組固有免疫因子Mov10、TRIM22的mRNA表達水平較正常對照組顯著升高,差異具有統計學意義(P＜0.01)(圖1,A、B)。 兩組間 IFN-α、IFN-γ的 mRNA 表達水平比較差異無統計學意義(P＞0.05)(圖1,C、D)。

2.2 耐藥組固有免疫因子TRIM22、Mov10、IFN-α和IFN-γ的mRNA表達相關性分析機體固有免疫因子IFN-α,Mov10,IFN-γ,TRIM22均具有抗乙肝病毒作用,其作用機制不同,其互相之間也具有相關性。經統計學分析,TRIM22 mRNA表達水平與IFN-α mRNA,IFN-γ mRNA,Mov10 mRNA 表達水平均相關(圖 2,A、B、C)；Mov10 mRNA 表達水平與TRIM22 mRNA、IFN-αmRNA表達水平具有相關性,與IFN-γmRNA表達水平無相關性(圖2,C、D、E)；IFN-αmRNA表達水平與 TRIM22 mRNA,Mov10 mRNA,IFN-γmRNA表達水平均相關(圖2,A、D、F)。

2.3 多重耐藥組與交叉耐藥組各免疫因子mRNA表達水平比較多重耐藥組與交叉耐藥組固有免疫因子 TRIM22、Mov10、IFN-α 和 IFN-γ 的 mRNA表達水平相互比較差異無統計學意義(P＞0.05)(見圖3)。

3 討論

目前眾多學者研究已證實固有免疫因子Mov10、TRIM22、IFN-α、IFN-γ 具有抗病毒作用。 人的Mov10基因位于1號染色體短臂1P13.2,主要在胚胎干細胞、睪丸、胸腺等器官表達。研究證實[7-8]HIV感染的Mov10小鼠模型體內無病毒血癥發生,說明Mov10模型小鼠具有抗HIV的作用。Mov10可以在多個階段抑制HIV復制：Mov10以RNA依賴的方式與HIV-1核酸蛋白相互作用,從而抑制HIV的包裝；Mov10屬于SF-1RNA解螺旋酶,它在RNA干擾途徑起重要作用,是RNA干擾抗病毒途徑的重要參與者；Mov10基因編碼的mRNA處理體(P小體)的標志蛋白可有效的嵌合入病毒體內,減少病毒感染。人類TRIM基因家族編碼的蛋白有70多種,TRIM22又名為Staf 50。TRIM蛋白作為機體固有免疫因子參與宿主的防御機制主要是伴隨干擾素和病毒刺激干擾病毒的轉錄[9]。TRIM蛋白抗病毒的機制[10-11]主要是調節正常蛋白代謝和清除降解病毒蛋白,TRIM22具有泛素E3連接酶活性在體外IFN-α可誘導TRIM22的上調,進一步增強其抗病毒功能；靈長類的TRIM22蛋白可被干擾素誘導上調,在抗病毒固有免疫中起到重要的作用；在人TRIM5aC端的SPRY結構域能特異識別HIV-1的核衣殼CA,抑制衣殼蛋白CA的脫殼從而抗HIV復制。干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質在機體的固有免疫中起重要作用。病毒、細菌感染會誘導生成Ⅰ型干擾素,T細胞的免疫應答會誘導生成Ⅱ型干擾素,干擾素具有抗感染(細菌、病毒),提升機體免疫應答作用[12]。

圖1 耐藥組與正常對照組固有免疫因子mRNA表達水平比較A.Mov10 mRNA； B.TRIM22 mRNA； C.INF-α mRNA； D.INF-γ mRNAFig.1 The mRNA level of inherent immune factors in drug-resistant group compared with the normal control group

圖2 耐藥組固有免疫因子TRIM22、Mov10、IFN-α和IFN-γ的mRNA表達相關性A：TRIM22 與 IFN-α；B：TRIM22 與 IFN-γ；C：Mov10 與 TRIM22；D：Mov10 與 IFN-α；E：Mov10 與 IFN-γ；F：IFN-α 與 IFN-γFig.2 The correlation of mRNA levels of the inherent immune factors including IFN-α,Mov10,IFN-γ,TRIM22A：TRIM22 and IFN-α；B：TRIM22 and IFN-γ；C：Mov10 and TRIM22；D：Mov10 and IFN-α；E：Mov10 and IFN-γ；F：IFN-α and IFN-γ

圖3 多重耐藥組與交叉耐藥組固有免疫因子TRIM22(A)、Mov10 m(B)、IFN-α(C)和IFN-γ(D)的mRNA表達水平比較Fig.3 The mRNA levels of inherent immune factors including TRIM22(A),Mov10(B),IFN-α(C)and IFN-γ(D)in the multidrug resistant group and cross resistance group

本研究發現在耐藥組CHB患者PBMC中Mov10 mRNA、TRIM22 mRNA的表達水平較正常對照組明顯升高,具有統計學意義(P＜0.01)。表明應用核苷酸類似物抗病毒治療的過程中,隨著HBV DNA耐藥株的增多,Mov10、TRIM22表達亦增強,有利于機體抑制HBV DNA復制以及清除病毒。但也有報道TRIM22 mRNA表達在未治療的CHB患者中是明顯降低的,表明其免疫功能下降,其推斷TRIM22是HBV感染的伴隨指標[13]。本研究中核苷酸類似物耐藥組中TRIM22 mRNA表達明顯升高,推測在抗耐藥HBV中TRIM22發揮重要作用。TRIM22作為固有免疫因子參與機體的免疫反應,亦反映機體的免疫狀態,其在未治療的CHBHBV DNA患者中是明顯降低的,推測此類患者機體免疫狀態尚未激活,或處于乙肝免疫耐受狀態,固有免疫因子TRIM22表達降低,而本研究中耐藥CHB患者處以免疫激活期,在核苷類藥物治療過程中出現HBV DNA耐藥,TRIM22高表達與機體免疫系統清除病毒相關,具體的相關機制尚需進一步深入研究。耐藥CHB組 IFN-αmRNA、IFN-γmRNA表達與正常對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05),表明機體固有免疫抗耐藥HBV機制不是通過干擾素途徑達到抗病毒作用的。耐藥的HBV不能刺激機體使IFN-α mRNA、IFN-γ mRNA 表達上調,清除乙肝病毒耐藥株,耐藥株持續存在,導致臨床抗病毒療效差,病情進展。本課題還探討了在耐藥組中這4個固有免疫因子的相關性,發現耐藥組中 TRIM22 mRNA表達水平與 IFN-αmRNA,Mov10 mRNA和IFN-γmRNA均呈正相關,表明 TRIM22抗耐藥HBV機制與多種固有免疫因子相關,推論它在抗耐藥HBV中起重要作用。另外,Mov10 mRNA表達水平與IFN-αmRNA和TRIM22 mRNA的表達呈正相關,與IFN-γmRNA無關,推測Mov10抗耐藥HBV機制不是通過干擾素激發的免疫途徑清除病毒的。IFN-α mRNA 表達水平與 IFN-γ mRNA、Mov10 mRNA、TRIM22 mRNA表達正相關,可推論 IFN-α mRNA表達與其他固有免疫因子在抗耐藥HBV過程中起到協同抗病毒作用。固有免疫因子間的相關性較為復雜,機制仍不明確,尚需進一步研究。

總之,本研究結果表明核苷(酸)類似物抗HBV治療出現臨床交叉耐藥及多耐藥的發生與機體的固有免疫因子有相關性,但具體的發生機制還需進一步深入研究。

利益沖突無