人偏肺病毒檢測方法研究進展

王超 鄭麗舒

100052北京,中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所

急性呼吸道感染(acute respiratory tract infection,ARI)是一種導致全球人群發病和死亡的主要病因,2001年首次鑒定出的人偏肺病毒(human metapneumovirus,hMPV)已被證實在各年齡段都能引起ARI,且幾乎所有5歲以下的兒童都感染過hMPV[1]。人血清中hMPV抗體檢測結果表明,該病毒至少從20世紀50年代起就一直在人群中傳播[2]。雖然hMPV感染所致癥狀一般表現溫和,但在特殊人群中也能引發致死性并發癥,因此建立及時準確有效的檢測方法很重要。

1 hMPV分子特點及致病性

hMPV屬于單分子負鏈RNA病毒目,副粘病毒科,肺病毒亞科,肺病毒屬?；蚪M長約13.3kb[3],可分為A、B兩型,根據G基因和F基因序列的不同,進一步將其分為A1、A2、B1和B2四個亞型[4],其中A2還可分為A2a和A2b基因簇[5]。hMPV基因組為單負鏈RNA,包含8個蛋白編碼基因,編碼9個蛋白,從3′端到5′端依次為N-P-M-F-M2-SH-GL,分別為核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、融合蛋白(F)、轉錄延長因子(M2-1)、RNA合成調節因子(M2-2)、小疏水糖蛋白(SH)、粘附蛋白(G)和病毒聚合酶(L)。 病毒RNA 與P、N、L、M2-1、M2-2蛋白共同形成直徑為17 nm的核衣殼,表面有由M蛋白和脂質形成的包膜,包膜上含有由F、G和SH組成的刺突。在F蛋白和G蛋白的參與下,hMPV與細胞表面硫酸肝素受體結合進入細胞。

hMPV感染在免疫功能正常的個體中癥狀表現很溫和,但對于早產兒、兒童、老年人和免疫受損患者,hMPV可以導致顯著的發病率和死亡率。據報道,32.7%hMPV感染患兒為有早產史的學齡前兒童,這些患兒患哮喘的機率更高[6]。hMPV感染還可導致足月孕婦的急性呼吸窘迫綜合征[7],引發嬰兒呼吸道感染合并難治性癲癇持續狀態和重癥腦炎[8]。在惡性血液病患者中hMPV感染導致的重癥肺炎可合并多器官功能衰竭[9]。此外,hMPV還能在肺移植患者中引發嚴重感染[10]。一般來說,hMPV感染在ARI患者中所占的比例為4% ～16%[11],但不同地域和不同年份感染率會有所變化[12]。hMPV感染患者在臨床癥狀上與呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒(RV)感染十分相似[13],一般僅表現為輕度上呼吸道感染,嚴重者出現危及生命的細支氣管炎和肺炎,很難從臨床角度判斷感染病毒種類,因此建立合適特異的實驗室檢測方法極為必要。

2 hMPV檢測方法的研究

2.1 分離培養hMPV在很多傳代細胞系中都能分離培養,如 Vero、HEp-2、Hep G2、293 和 LLC-MK2等[14-15],培養過程中需外源加入 TPCK胰酶對hMPV的 F蛋白進行切割以獲得感染性[2,16]。hMPV復制動力學很慢,出現細胞病變(CPE)時間晚,在不同細胞系中CPE的表現不同,有時還需盲傳培養,實驗周期長,所以目前臨床診斷很少用到細胞培養。但作為檢測病毒感染的金標準[17],細胞培養具有簡便、低成本和不需要復雜器械等優點,適合普通實驗室操作。細胞培養能直觀反映病毒與細胞間的相互作用,是病毒學和臨床研究的基礎,尋找合適有效的病毒分離培養方法具有十分重要的研究意義。

Reina等[18]通過Shell Vial Cultures技術對臨床hMPV感染的呼吸道樣本進行培養,結果表明這能成為一種快速、可靠的臨床實驗室診斷方法。Isaeva等[19]用19種人和動物細胞系培養hMPV,發現hMPV對人類細胞中的clone 1-5C4株和貓腎細胞CRFK最敏感。Sato等[20]使用人惡性黑色素瘤細胞MNT-1培養hMPV,發現相對于LLC-MK2和Vero E6,MNT-1能更早出現合胞體病變。此外,hMPV能在人正常呼吸道上皮細胞(BEAS-2B、16HBE140)中良好復制產生包涵體,且不需要外源加入TPCK胰酶[3,14],但也有研究表明hMPV在原代和傳代細胞系中感染率沒有差別[21]。利用Transwell培養板建立起的3D立體培養原代人呼吸道組織細胞(HAE)模型也可用于hMPV的感染研究[22],該模型能以更接近人體真實的環境揭示hMPV的感染機制和進行藥物評價。

2.2 核酸檢測

2.2.1 PCR方法：由于hMPV在細胞中生長緩慢,臨床檢測主要采用逆轉錄PCR(RT-PCR)方法。hMPV N基因在核酸序列和氨基酸序列都是最保守的(分別為91.2%和98.4%),常用于hMPV檢測,G基因是差異最大的(分別為79%和59.2%)[23],可用于分型,通過real time RT-PCR擴增hMPV這兩個基因,進行測序就可以鑒別診斷出hMPV的四種亞型[24]。另有研究顯示僅檢測N基因也能鑒定出aMPV和hMPV所有亞型[25]。此外,還可通過逆轉錄環介導等溫擴增(RT-LAMP)法擴增hMPV M基因來鑒別hMPV的A、B型,該法具有較高的特異性和靈敏度,且不需要復雜的儀器,適用于實驗條件簡單的現場檢測[26]。由于呼吸道感染多為混合感染,逐個排查費時費力,利用FRET雜交探針和 SYBR Green染料[27-28]建立多重實時熒光定量檢測PCR方法能一次檢測多種DNA和RNA病毒,具有降低本低,簡便快捷等優點。BioFire公司通過微流控技術發明的FilmArray Respiratory Panel(FilmArray RP)是一種集樣品制備、擴增、檢測和分析功能于一體的多重PCR系統,可用于檢測急性呼吸道感染中常見病毒、細菌或真菌,具有簡單、高效、快速的特點[29]。

2.2.2 核酸測序：RNA病毒由于基因組容易變異,除選擇高度保守的區域進行PCR檢測之外,常需要結合測序進行確認。測序技術能夠準確提供hMPV流行株的變異情況,為研究hMPV致病機制提供依據。西班牙巴塞羅那兒童hMPV感染曾出現一種180 bp重復片段突變株,這種突變株很快成為了當季流行株[30]。日本橫濱地區臨床hMPV樣本G基因測序分析時,也發現有46.9% 的 A2b基因簇hMPV G基因產生了180 bp重復片段突變,該突變導致G蛋白產生了60個氨基酸殘基的重復序列,是O鏈糖的潛在受體,可能導致hMPV對宿主免疫逃逸[31]。此外,近年興起的二代測序和三代測序技術能夠及時提供更為準確有效的測序信息。

2.2.3 xMAP和xTAG技術：xMAP和xTAG技術是Luminex公司自創的熒光微球編碼技術和標簽技術,是臨床應用型生物芯片主要采用的技術之一,已廣泛用于生命科學的各個領域。Luminex在此基礎上發明的xTAGRespiratory Viral Panel(RVP呼吸道病毒檢測試劑盒)可同時檢測19種呼吸道病毒及亞型,而相對于 xTAG RVP,Luminex 2015年推出NxTag respiratory pathogen panel(NxTAG RPP)還能同時檢測肺炎支原體和肺炎衣原體,對于某些病毒有更好的靈敏度[32]。與多重RT-PCR技術相比,NxTag技術也有高特異性、高靈敏度,操作更方便快捷等優點。研究者也可根據自己的實驗需求靈活應用xMAP和xTAG技術,Yan等[33]在xMAP技術上融合多重RT-PCR技術建立了高通量多路液相芯片(rMLA),可同時檢測6種常見呼吸道病毒。

2.3 血清學檢測與抗原檢測

2.3.1 酶聯免疫吸附法(ELISA)：hMPV編碼三種表面蛋白,F、G和SH蛋白,其中F蛋白可以誘導有效的中和抗體,而G蛋白和SH蛋白的免疫原性很弱。采用單一重組抗原的ELISA只能檢測血清中一種hMPV抗體,不能準確反映病毒感染情況,而Okamoto等[34]利用hMPV全部抗原建立的ELISA方法可以檢測患者血清中所有hMPV抗體,適用于臨床實驗室檢查和大規模篩查。此外,將金屬增強熒光法(MEF)與ELISA方法結合,通過高通量金屬增強熒光生物傳感器(HT-MEFB)檢測hMPV抗體,能顯著提高ELISA檢測的靈敏度[35]。

2.3.2 免疫熒光標記法：免疫熒光標記法分為直接免疫熒光法(DIF)和間接免疫熒光法(IFA),其中DIF因能在短時間特異地檢測病原體,是實驗室檢測hMPV的常用方法。但也有研究表明雖然DIF有很高的特異性(99%),但檢測靈敏度卻很低(38%),不適用于臨床實驗室檢測[36]。相對于DIF,IFA在靈敏度和特異性上均高一些,hMPV小鼠單克隆抗體(mAb)能夠特異識別hMPV的N蛋白,靈敏度達到100%[37]。免疫熒光標記法的局限性在于其檢測設備較貴且結果需要人為解讀,陽性判斷的主觀性較強。

2.4 其他檢測方法質譜(MS)技術具有快速、靈敏、特異、高通量、低成本的特點,廣泛用于細菌的檢測,但在病毒檢測的應用還很少。液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)技術可用于檢測臨床樣本和分離培養樣本中的hMPV蛋白質組[38]?；|輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)技術也可用于檢測呼吸道病毒,相對于LC-MS/MS,MALDI-TOF MS能更迅速的鑒定病毒的型別,但LC-MS/MS具有更高的靈敏度,能夠鑒定出樣本中不同病毒[39]。質譜技術檢測呼吸道病毒對臨床樣本的要求較高,需要進行前期處理并優化處理條件。

3 小結

hMPV是一種重要的呼吸道病毒,患者對于hMPV感染難以產生持久的免疫,常產生復發感染,截至目前,hMPV感染仍是常規的抗病毒治療和對癥治療,沒有疫苗。實驗室檢測hMPV主要采用PCR和DIF,但完善傳統的細胞培養方法及新建立的質譜方法能為hMPV檢測提供更全面的信息,根據不同的實驗需求采用不同的檢測方法更有助于研究hMPV的分子流行病學、抗病毒藥物和疫苗研發,以加強未來對hMPV的預防和控制能力。

利益沖突無