酸性富含亮氨酸的核磷蛋白32家族成員A 對心肌細胞肥大的影響及機制研究

沈立君 黃永平 祝學勇 劉葉 李紅良

心肌肥厚是由生理或病理刺激導致的心臟復雜的重塑過程，早期階段，心臟肥厚是針對各種刺激產生的適應性反應，可以有效的改善心功能，降低心室壁張力。但是，長期持續性的病理性心肌肥厚導致心臟擴張及一系列失代償反應，最終導致心力衰竭甚至猝死的發生[1]。尋找靶向心肌肥厚發生發展的重要調控因子是預防和治療病理性心肌肥厚及其所導致的心力衰竭的有效手段。

酸性富含亮氨酸的核磷蛋白32家族成員A(acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A, Anp32a)，屬于進化上保守的蛋白質家族，其結構特征是富含亮氨酸殘基的氨基端結構域和羧基端酸性末尾。研究表明，Anp32a參與多種細胞生命活動過程的調節，包括RNA轉運、轉錄，細胞凋亡，囊泡運輸和細胞內信號轉導[2]。Anp32a在正常組織以及多種癌癥，如乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌中表達，并且能夠抑制乳腺癌和前列腺癌的進展，同時也參與調控神經退行性疾病[3]。筆者以Anp32a敲低和過表達的細胞為研究對象，以探討Anp32a在血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)刺激誘導的心肌細胞肥大中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1生物信息數據分析

在GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)中搜索小鼠心臟主動脈縮窄手術(TAC)組的芯片數據，選擇GSE5500數據庫插入一篇參考文獻中假手術(Sham)組與TAC組進行差異分析。使用R軟件包affy讀取基因芯片的數據，R軟件包gcrma對芯片基因的表達量進行標準化，并使用t檢驗進行差異顯著性檢驗。差異基因篩選標準為差異表達倍數大于2，且統計學檢驗P值小于0.05。使用R語言ggplot2軟件包，繪制基因表達的火山圖。

1.2小鼠心臟主動脈縮窄手術

C57背景野生型，SPF級，8～10周齡雄性小鼠，隨機分為模型組和假手術組，利用主動脈縮窄手術構建心肌肥厚模型。小鼠稱重后，3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉成功后，左側胸部備皮，固定于倒V形板斜面上，進行氣管插管并連接呼吸機。用碘酒及75%酒精充分消毒手術區域皮膚3遍，于第二、三肋間距胸骨左緣2 mm處用剪刀分離肋間肌打開胸腔，顯微擴胸器將胸部擴開，充分暴露手術視野，鈍性分離出主動脈弓降支，將7-0手術絲線穿過血管，墊針平行放置于主動脈上，打結后迅速去除墊針，術畢關閉胸腔。術后密切觀察小鼠狀態。假手術組鈍性分離主動脈降支后僅穿線不結扎，余步驟與模型組一致。

1.3細胞與分子實驗

1.3.1分子克隆 引物序列(Anp32a-seq-F CCGCTCGAGATGGAGATGGACAA，Anp32a-seq-R CGCGGATCCGTTAGTCATCCTCTTG)，由上海生工生物工程股份有限公司合成，從大鼠cDNA擴增Anp32a，通過XhoI和BamHI酶切與載體pENTR-CMV連接，構建穿梭載體，通過Gateway?LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix(Invitrogen公司)試劑盒將pENTR-CMV-Anp32a載體與pAd-PL-DEST載體重組，得到包裝腺病毒的過表達質粒。

針對大鼠Anp32a基因序列設計RNA干擾靶序列GCAGAGAAATGTCCGAACCTT，在該序列基礎上合成shRNA正義鏈：CCGGGCAGAGAAATGTCCGAACCTTCTCGAGAAGGTTCGGACATTTC-TCTGCTTTTTG，反義鏈：AATTCAAAAAGCAGAGAAATGTCCGAACCTTCTCGAGAAGG-TTCGGACATTTCTCTGC，引物融合后與AgeI和EcoRI酶切的載體pENTR-U6連接，構建穿梭載體，通過Gateway?LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix(Invitrogen公司)試劑盒將pENTR-U6-Anp32a-shRNA載體與pAd-PL-DEST載體重組，得到包裝腺病毒的敲低質粒。

1.3.2細胞轉染與感染 重組腺病毒質粒經PacI酶切線性化、純化，然后轉染293A 細胞擴增，最后將多次擴增的病毒液利用氯化銫密度梯度離心-透析聯用法進行純化。利用穿梭質粒上帶有的獨立啟動子表達的GFP來初步判定病毒液的滴度。用純化后的病毒液感染H9C2心肌細胞24 h后，細胞饑餓處理12 h，加入終濃度為1 μmol/L 的AngⅡ刺激細胞，對照組使用等量PBS混合，刺激時間48 h。

1.3.3蛋白印記(Western blot)檢測 提取細胞總蛋白，使用BCA蛋白檢測試劑盒(23225; Thermo Fisher Scientific)定量并調平樣品濃度，將蛋白樣品按30 μg/孔的上樣量依次加到SDS-PAGE膠進行電泳，電泳結束后用濕轉法轉移蛋白至PVDF膜。將轉有蛋白的PVDF膜放置TBS中洗去轉膜液，5%的脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，加入對應一抗，4℃搖床過夜，次日加入對應二抗，室溫孵育1 h，于儀器Bio-RadChemiDocTMXRS+中顯影，檢測目的條帶。文中所用到的一抗包括Anp32a(sc-5652, Santa cruz公司)，Anp(A1609, Abclonal公司)，β-Mhc(22280-1-AP, Proteintech公司)，p-Akt(4060, CST公司)，Akt(4691, CST公司)，Gapdh(2118, CST公司)。

1.3.4實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR) 使用TRIZOL(15596-026，Invitrogen)提取細胞、小鼠心臟組織總RNA，Nanodrop 2000(Thermo Fisher Scientific，Madison)和凝膠電泳對分離的RNA進行定量并檢測其完整性。按照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(4896866001; Roche)說明書逆轉錄RNA成cDNA。使用LightCycler 480 SYBR Green 1 Master Mix(04887352001，Roche)對PCR擴增產物進行定量。采用Gapdh作為內參基因校準靶基因。文中所用到的引物(武漢擎科創新生物科技有限公司合成)見表1。

表1 qPCR所需的引物序列

1.3.5細胞免疫熒光染色 細胞大小及面積通過細胞免疫熒光染色分析[4]。腺病毒感染24 h后，用AngII及PBS處理H9C2心肌細胞48 h，將細胞置于預熱(37℃)的100%甲醇中孵育20 min,以淬取GFP綠色熒光信號，用0.1%Triton X-100于PBS中洗5 min，并用α-輔肌動蛋白(05-384，Merck Millipore，1∶100稀釋)染色，加入熒光二抗(驢抗小鼠IgG(H + L)二抗，A21202 ，Invitrogen，1∶200)，DAPI封片，于正置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4統計學方法 所有檢測結果均使用平均數±標準差表示，采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，兩組之間均數比較使用獨立樣本t檢驗，多組間均數比較使用單因素方差分析，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1生物信息數據庫心臟組織Anp32a的表達

通過挖掘分析數據庫(GSE5500)中小鼠心臟組織假手術組與TAC組的芯片數據，發現Anp32a的表達顯著下調。如圖1所示，紅色的點代表TAC手術后表達上調的基因，綠色的點代表TAC手術后表達下調的基因，黑色的點代表沒有變化的基因。

圖1 火山圖

2.2Anp32a在假手術組及TAC組不同時間點心臟組織中的表達

qPCR結果顯示Anp32a在兩組心臟組織中的mRNA相對表達水平，與假手術組相比，Anp32a在TAC組的表水平隨著TAC手術時間延長逐漸降低。見表2。

表2 不同組別Anp32a基因表達

注：與sham組相比，*P<0.05

2.3AdAnp32組及AdGFP組細胞大小及心肌肥厚指標表達水平的比較

Western blot顯示AdAnp32感染細胞其蛋白表達水平增加(見圖2A)，在AdAnp32a感染心肌細胞24 h后，AngII刺激48 h，免疫熒光染色結果顯示AdAnp32a組細胞明顯小于AdGFP對照組(見圖2B)。Image-Pro Plus 6.0分析計數400倍顯微鏡下心肌細胞面積(cell surface area, CSA)，結果見表3。進一步裂解細胞取其上清，通過qPCR進行心肌肥厚相關基因Anp、Bnp、β-Mhc的檢測。如表4所示，AdAnp32a組與其對照AdGFP組相比，Anp、Bnp、β-Mhc基因表達水平降低。

圖2 AdGFP組和AdAnp32a組蛋白表達(A)和免疫熒光染色(B)

表3 兩組細胞大小面積統計/μm2

注：與AdGFP組比較，*P<0.05

表4 不同組別心肌肥厚基因表達

注：n=3次重復實驗。與對照組比較，*P<0.05

2.4AdshAnp32組及AdshRNA組細胞大小及心肌肥厚指標表達水平的比較

Western blot顯示AdshAnp32感染細胞檢測Anp32a蛋白表達水平明顯降低(見圖3A)，細胞免疫熒光染色結果顯示AdshAnp32a組細胞較AdshRNA對照組明顯增大(見圖3B)。細胞面積分析結果見表5。提取細胞總RNA，qPCR檢測兩組Anp、Bnp、β-Mhc的基因表達，AdshAnp32a上述基因表達較其對照組明顯升高，見表6。

圖3 兩組Western blot結果(A)和細胞免疫熒光染色(B)

表5 兩組細胞大小面積統計/μm2

注：與AdshRNA組組比較，*P<0.05

表6 兩組心肌肥厚基因表達

注：n=3次重復實驗。與AdshRNA組比較，*P<0.05

2.5Anp32a對AKT信號通路的影響

如圖4所示，與PBS對照組相比，AngⅡ刺激條件下，Anp、β-Mhc、Akt磷酸化蛋白的水平升高,過表達Anp32a能抑制其升高。

圖4 Anp、β-Mhc、p-Akt的蛋白表達

3 討論

本研究采用Anp32a敲低和過表達的H9C2心肌細胞為研究對象，通過AngⅡ刺激來探討Anp32a基因在心肌細胞肥大中的作用。實驗結果顯示Anp32a在心肌肥厚模型中表達顯著降低，這與Gao等[5]研究結果相似。過表達Anp32a明顯減輕AngⅡ刺激誘導的心肌細胞肥大，并且顯著降低Akt的磷酸化水平。因此，Anp32a可能通過抑制AKT信號通路，在AngⅡ刺激誘導的心肌細胞肥大過程中起到負調節作用。

Anp32a家族的成員被廣泛認為是核-質穿梭蛋白，涉及不同的信號轉導途徑及許多重要的細胞過程，包括增殖、分化、細胞凋亡、腫瘤抑制、調節mRNA運輸和穩定性、抑制組蛋白乙酰轉移酶和基于微管功能的調節。Anp32a結構上由富含亮氨酸重復序列(LRRs)結構域的高度保守的N-末端和主要由聚谷氨酸組成的C-末端組成，其中前者是介導蛋白質-蛋白質相互作用的基序[6]。在當前的研究中，我們發現Anp32a能夠在心肌細胞中表達，且在病理性心肌肥厚中表達顯著下調。通過構建腺病毒介導Anp32a敲低和過表達的質粒，我們首次發現Anp32a敲低(AdshAnp32a)能夠促進心肌細胞肥大，而Anp32a過表達(AdAnp32a)則抑制這一過程。

病理性心肌肥厚發病機制復雜，包括G蛋白偶聯受體(GPCR)、絲裂原活化的蛋白激酶(MAPK)級聯、鈣調磷酸酶-NFAT通路(calcineurin-NFAT circuit)、磷脂酰肌醇3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(PI3K-AKT)信號通路等[7-8]在內的多種細胞內信號通路在心肌肥厚的發生發展中發揮關鍵調控作用。其中，S473和T308介導的AKT磷酸化激活在細胞存活、增殖、代謝、生長等方面發揮重要作用。值得注意的是，在出生后的心臟中，PI3K-AKT-FOXO軸調節心肌細胞大小，其中AKT和FOXO3a的磷酸化水平與體內心臟肥大呈正相關[9]。我們的研究結果顯示，AdAnp32a能夠抑制AngII刺激誘導的病理性心肌肥厚中磷酸化的AKT水平的上調。此外，Anp32a是磷酸酶2A(PP2A)的強效抑制劑[10]，而PP2A是參與調控細胞多種基本功能的重要絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶[11]。PP2A可能參與Anp32a-AKT調控的病理性心肌肥厚。

綜上所述，本研究發現Anp32a在心肌細胞肥大模型中表達降低，過表達Anp32a可有效抑制心肌細胞肥大，這一作用可能是通過抑制AKT等信號通路實現的。因此，靶向Anp32a可能成為預防和治療病理性心肌肥厚的新策略。

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