透明質酸酶的研究進展

韓旭

【摘 要】透明質酸酶是一類能夠降解透明質酸酶的酶的總稱，廣泛分布于自然界，存在于哺乳動物、昆蟲、水蛭和細菌中。近年來，關于透明質酸酶的研究逐漸增多，其在醫學、整形等領域的應用受到人們的重視。文章介紹了透明質酸酶的研究進展，對于其分類、來源、活性測定和應用進行了綜述。

【關鍵詞】透明質酸酶；分類；來源；活性測定；應用

透明質酸酶（Hyaluronidases， 簡稱HAase）是一種廣泛分布、能夠降解透明質酸（HA）產生低分子化的酶的總稱[1]，大多數能夠降解硫酸軟骨素（Chondroitin，CS），但速度較低。最初發現透明質酸酶，是在1928年，發現睪丸及其他組織中的提取物，通過促進其他有害的毒液成分的滲透和增強它們在血液中的行動不變性組織，發揮“擴散因子”的作用。1940年，Meyer將這種“擴散因子”正式命名為Hyaluronidase。不同來源的HAase具有一定的差異性，但從其被發現以來，逐漸獲得了人們的關注，已經被廣泛應用于醫藥等領域。也基于此，HAase的性質等相關研究成為了一個值得關注的領域。

一、透明質酸酶酶的分類

根據透明質酸的作用機理，將HAase分為三種類型（Meyer， 1971）：（a） 內酰胺-β- N -乙酰- D - 氨基葡糖苷酶（EC 3.2.1.35）：該酶屬于水解酶，將高分子量底物（HA）作為主要末端產物的通過內切的作用方式，作用于β-1，四糖苷鍵進行水解，降解后得到的終產物主要為飽和的四糖和六糖。來自于膜翅目（Hymenoptera）毒液和哺乳動物精子等動物來源的均屬于此類。該的酶也催化轉糖基反應，在HA的水解期間產生六糖和八糖。與后面兩種透明質酸酶不同的是，這一組不僅作用于HA，還作用于硫酸軟骨素。（b） β-葡糖苷酸酶（EC 3.2.1.36）：來源于水蛭和鉤蟲中，屬于水解酶，通過內切作用方式，作用于β-1，3糖苷鍵，降解后得到的終產物為四糖，且該酶為特異性降解HA。（c） 透明質酸裂解酶（hyaluronate lyase，簡稱HL）（EC 4.2.2.1）：多數是以細菌為代表的，還包括真菌和病毒來源的一組酶，通過β-消除機制的N-乙酰己糖胺酶，通過作用于β-1，4 糖苷鍵，在C-4和C-5之間引入不飽和鍵。與前兩種HAase不同，HL的最終產物是二糖而不是四糖或六糖。不同菌屬來源的HL，在底物特異性上表現有所不同。

隨著分子生物技術的發展，還可以將HAase分為兩大類，依據其蛋白同源性，將其分為真核生物來源的HAase和原核生物來源的HAase。

二、透明質酸酶的來源

透明質酸酶的來源廣泛，分布于各種脊椎動物（睪丸、動物毒液等）和無脊椎動物（昆蟲、水蛭，十二指腸蟲等）中，還存在于微生物中（鏈霉菌屬，葡萄球菌屬、梭菌屬等）。

（一）真核生物來源的HAase

在人類基因組中已經發現了六種HAase-相似序列的基因編碼，它們都顯示出高度的同源性。它們包括人類的HYAL-1、HYAL-2、HYAL-3、HYAL-4和PH20，以及在人類中轉錄但未翻譯的假基因HYAL-Phyal1。前三個來源于人的HAase基因（HYAL-1、-2、-3）聚集在染色體3p21.3位點，而后者的3個基因在染色體7q31.3位點上聚集。在此基礎上，HAases被分為兩部分。它們大多數被認為是酸性的，因為它們的活性在酸性條件下最高。相反，PH20是中性活躍的HAase，因為它在中性 pH中活性最高的，商品化的重組人透明質酸酶的氨基酸序列是PH20，其在醫藥領域應用廣泛，是已發現的人類透明質酸酶唯一一個最適宜體內的中性生理環境同時保持高活性的酶[2，3]。2015年，美國FDA批準一種名為Halozyme的重組人類透明質酸酶注射劑，作為其他注射藥物的輔助藥物，用于皮下注射等促進藥物擴散和吸收，但是重組人透明質酸酶價格昂貴，無法實現大規模應用，市面上目前只有國外能夠購買到該種酶，且由于其的免疫原性，使之不能隨意購買，因此想要使其能夠在我國醫藥領域廣泛使用，現在的情況不是很樂觀。

目前市售的HAase中應用最為全面的是來自于牛睪丸提取的透明質酸酶（bovine testicular hyaluronidase， 簡稱BTH），最初是PrimaPharm公司研制的純化牛睪丸透明質酸酶。BTH為中性HAase，主要將HA降解，終產物四糖和飽和二糖，且其還可以降解其他種類的糖胺聚糖硫酸軟骨素。但提取后的該酶純度低，摻雜了許多雜蛋白，無法保證酶的純度，且其由于來源于動物，具有較強的免疫原性，容易引起過敏反應。

來自水蛭和十二指腸蟲等的β-葡糖苷酸酶（EC 3.2.1.36）作用于β-1-3糖苷鍵之間。這種類型的酶還有待進行深入研究。其水解降解機制類似于脊椎動物的HAase。然而，在研究它們的催化機理時，該類型的酶與脊椎動物的HAase降解模式的差異仍然存在。

（二）原核生物來源的HAase

在CAZy數據庫中，微生物來源的透明質酸酶屬于多糖裂解酶第8、16家族（PL8、PL16），有些噬菌體也能產生透明質酸酶，但是它的分子量遠小于細菌HAase的分子量，而且在胞外環境下測得的活性很低。

多種細菌、噬菌體、真菌可表達產生HL，通常稱其為消除酶或裂解酶（EC 4.2.2.1），通過β消除機制引入不飽和雙鍵。很多細菌都可以產生HL，其中革蘭氏陽性菌（Gram-positive，G+），經報道，大多屬于致病菌例如鏈球菌（Streptococcus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、[4， 5]等，這些致病菌通過動物或人類的皮膚擦傷，逃過其防衛機制引起感染。過程是其將自身的HL分泌到胞外通過降解宿主體內的透明質酸，使宿主體內的高分子HA參與免疫調節且具有抗炎活性，而微生物產生的HL將高分子HA降解成寡聚透明質酸，使其作為炎癥反應的誘導因子，在宿主體內建立適合該細菌自身的生長環境，使宿主患滑膜炎、敗血癥等的風險大大提高。而來自革蘭氏陰性菌（Gram-negative，G-）中的HL，則屬于周質酶，為胞內酶，在發病機制中起作用的可能性較小，其中一些HL也有較低的軟骨素裂解酶活性。細菌和真菌來源的HL，分子量一般較大，而細菌來源的酶純化工藝較簡單，且來源更廣，成本較低，因此其市場應用價值更高。許多噬菌體產生的酶通常隨噬菌體附于細菌膜表面，膜中所富含的HA利于其生長，通過初始的非漸進性的內溶活性來消化HA，然后以不飽和二糖作為最終產物。

病毒來源的HL蛋白序列與細菌來源的相似性極低，且分子量遠小于細菌和真菌來源的。研究發現，有些不飽和透明質酸寡糖，例如由噬菌體透明質酸酶HylP[6]產生的不飽和透明質酸寡糖，不僅不會促進乳腺癌細胞的生長，還可以減少乳腺癌細胞的增殖、轉移和入侵，因此可能可以利用HylP獨特的酶活性抑制透明質酸介導的腫瘤生長和進展。來源于釀膿鏈球菌的透明質酸裂解酶對降解HA后得到不飽和透明質酸具有一定的抗氧化活性，而這些功能是飽和透明質酸片段無法達到的，因此微生物產生的HL對于降解產生不飽和透明質酸寡糖的這些特殊的生物學功能具有更廣闊的應用前景。

三、透明質酸酶活性的測定方法

隨著對透明質酸酶的深入研究，經文獻報道，常見測定透明質酸酶活性的方法很多，如ELISA-like法、平板法、化學修飾法和毛細管電泳法等諸多方法。但應用較多的是濁度法、3，5-二硝基水楊酸法（3，5-dinitrsalicylic，DNS）和232nm法等方法。

濁度法：大分子量的透明質酸鹽在酸化血清中能夠發生沉降現象，但是經過降解的HA在相同條件下仍然澄清。經過不斷的研究，對濁度法不斷修正，發現馬、兔和人血清、血清白蛋白、牛血清白蛋白、十六烷基三甲基溴化氨和西吡氯銨等均可以作為蛋白沉淀試劑均可以用來測定酶活性，可使用馬血清作為沉淀劑。美國藥典（采用馬血清作為沉淀劑，透明質酸酶是以USP標準透明質酸酶（USP Hyaluronidase Reference Standard）為標準酶進行酶活測定。中國藥典（版）也是釆用血清作為與反應的沉淀劑，以標準酶作為標準品進行酶活測定。酶活定義：在特定溫度條件下，0.1mg HA 在30min內引起的濁度降低50%引起的濁度變化所需的酶量定義為1個酶活力單位。

DNS法：3，5-二硝基水楊酸法（3，5-dinitrsalicylic，DNS法），原理是在堿性環境中DNS與透明質酸酶的降解產物的還原性末端發生化學反應，反應產物煮沸后呈現紅棕色，顏色深淺在一定范圍內與還原糖含量呈線性關系，還原糖含量越高，顏色差越明顯，585nm下檢測獲得還原性糖的量來反映酶活力。酶活力定義：以每10min產生1nM還原糖需要的酶量定義為一個酶活力單位（U/mL）。

232nm法：糖胺聚糖裂解酶與糖胺聚糖底物反應會產生不飽和雙鍵，這種不飽和雙鍵在232nm處具有光吸收，在一定范圍內，吸光度值與不飽和雙鍵的含量呈線性關系，因此可以通過測定OD232下光吸收的數值來檢測底物中不飽和雙鍵的數量，進而顯示產物的生成量來確定酶活力的大小。酶活力定義為：每分鐘催化產生1 μmol還原糖所需的酶用量定義為一個酶活力單位（U）。

四、透明質酸酶的應用

首先，可以應用透明質酸酶來制備低分子透明質酸和透明質酸寡糖，從而使低分子透明質酸（LMWHA）和透明質酸寡糖（o-HA）可以發揮其生物學功能，促進新生血管生成、促進創傷愈合、抑制腫瘤等作用。有報道表明HAase降解產生的o-HA可以促進預產大鼠子宮頸收縮，從而縮短生產過程，HAase還有助于恢復大鼠損傷的脊髓的功能。

其次，由于最初作為“擴散因子”被發現，因此，透明質酸酶可以與其它藥物共同作用進行給藥，促進藥物的擴散和吸收。當用作為單次短期作用劑量，暫時地去除可被用來增強將溶液和藥物吸收入組織，使其組織液的黏度降低，從而增加膜的通透性將藥物傳送入間質空間。HAase對于麻醉劑的擴散是有效的，有助于治療性流體、分子和蛋白質的治療性的物質的擴散給藥。

HAase可以用于眼科手術幫助麻醉，青光眼、白內障手術中有效控制眼壓，視網膜玻璃體手術中降低HA的粘滯性有效降低手術危險。整形美容領域，透明質酸酶用于除皺或者面部注射透明質酸除皺后不良反應的后處理等。通過將人的HAase基因PH20與溶瘤腺病毒（oncolytic adenovirus，OAV）整合，使HAase發揮作用，降解HA，促進OAV在腫瘤細胞中的擴散，使腫瘤減小，提高療效[7]。人重組HAase-rhPH20還可以用于糖尿病治療中，可加速胰島素的擴散，更快達到最高作用，有效控制了糖尿病人的血糖濃度。同時，HAase具有很強的生血作用，增強血管的通透性，從而使藥物更容易暴露，由于HAase的各種作用，已經廣泛應用于臨床中。

五、總結

透明質酸酶是一種廣泛分布和被忽視的酶，具有不同的底物特異性，廣泛的pH值，不同的催化機制和各種各樣的功能。然而，在這一領域已經做了許多的工作，但在酶學方面仍然有很多工作要做，特別是三維結構和定點突變和酶促動力學，以增強對結合位點、底物識別和催化機制的理解?？寺「嗟闹亟M酶可以確定這些透明質酸酶的分類和聯系。進一步研究純化后的透明質酸酶的底物的結構，以提高對酶的協同作用的理解。關于表達調控有許多未解的問題，包括完整的基因序列、協調調控的程度以及對假定誘導物反應的分子機制。隨著研究的深入，不同來源透明質酸酶的特性被逐漸發掘，這些為預防和治療透明質酸酶相關疾病提供新的途徑和理論依據。

【參考文獻】

1.Schwartzman， J.， Hyaluronidase. Journal of Pediatrics， 1951. 39（4）： p. 491-502.

2.Gmachl， M.， et al.， The human sperm protein PH-20 has hyaluronidase activity. Febs Letters， 1993. 336（3）： p. 545.

3.Csoka， A.B.， G.I. Frost， and R. Stern， The six hyaluronidase-like genes in the human and mouse genomes. Matrix Biology， 2001. 20（8）： p. 499.

4.Abramson， C. and H. Friedman， Staphylococcal hyaluronate lyase： purification and characterization studies. Journal of Bacteriology， 1968. 96（4）： p. 886.

5.Akhtar， M.S. and V. Bhakuni， Streptococcus pneumoniae hyaluronate lyase： An overview. Current Science， 2004. 86（25）.

6.Singh， S.K.， S. Malhotra， and M.S. Akhtar， Characterization of hyaluronic acid specific hyaluronate lyase （HylP） from Streptococcus pyogenes. Biochimie， 2014. 102（1）： p. 203-210.

7.Guedan， S.， et al.， Hyaluronidase expression by an oncolytic adenovirus enhances its intratumoral spread and suppresses tumor growth. Molecular Therapy the Journal of the American Society of Gene Therapy， 2010. 18（7）： p. 1275.