斷奶前補飼不同直/支鏈淀粉比開食料對羔羊瘤胃上皮發育的影響

孫大明，李弘偉，毛勝勇，劉軍花

(江蘇省消化道營養與動物健康重點實驗室，南京農業大學消化道微生物研究室，江蘇 南京 210095)

瘤胃是反芻動物重要的消化器官，新生羔羊瘤胃內壁光滑、顏色淺，隨日齡的增加和固體飼料的采食，瘤胃壁逐漸增厚、乳頭增長、瘤胃發酵功能逐漸建立[1]。同時，幼齡時期是動物胃腸道迅速發育的時期，其發育狀況對成年后的機體健康及生產性能具有重要影響[2]。所以在反芻動物幼齡期調節瘤胃的發育顯得尤為重要。研究表明盡早補飼開食料可以促進羔羊瘤胃發育，在實際生產中，犢牛和羔羊一般在出生后的7～10 d開始補飼高淀粉含量的開食料以促進羔羊瘤胃的發育。

淀粉是開食料中的重要成分，而淀粉在瘤胃中的降解受諸多條件的影響，如直鏈淀粉比例，淀粉結晶度和淀粉顆粒結構等[3]。Stevnebo等[4]通過體外研究發現淀粉中支鏈淀粉比例與淀粉的降解率呈顯著正相關。Ren 等[5]也發現高支鏈淀粉比例的淀粉在瘤胃中降解率比較高。研究表明，不同來源淀粉中直/支鏈淀粉比不同，在瘤胃中的降解率也不同，如木薯(Manihotesculenta)、水稻(Oryzasativa)和小麥(Triticumaestivum)支鏈淀粉含量較高，在瘤胃中的發酵率較高；豆類淀粉，尤其是豌豆(Pisumsativum)支鏈淀粉含量較低，在瘤胃內的降解率較低[6-7]。Lesmeister等[8]研究發現，與飼喂含有細磨玉米的開食料相比，犢牛飼喂含有易發酵蒸汽壓片玉米的開食料更能有效地促進瘤胃上皮的發育。所以推測羔羊飼喂不同直/支鏈淀粉開食料會影響羔羊瘤胃上皮的發育。本研究的主要目的將從形態及分子水平研究不同直/支鏈淀粉開食料對羔羊瘤胃上皮發育的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與動物飼養

試驗于2015年10-12月在江蘇省蘇州市湖羊種羊場進行。試驗選取24只體況良好、胎次一致、體重相近的初生羔羊(湖羊)，將其隨機分為木薯淀粉組(cassava starch，CS，n=8)、玉米(Zeamays)淀粉組(maize starch，MS，n=8)和豌豆淀粉組(pea starch，PS，n=8)(直/支鏈淀粉比分別約為0.11，0.27和0.44)。從10日齡開始，每天4:00-19:00將羔羊抱入補飼欄與母羊分離，各組羔羊自由采食不同直/支鏈淀粉比的開食料。其間在6:30, 10:30和15:30將羔羊抱回母羊舍哺乳1 h。試驗期間，羔羊自由飲水，單欄飼喂，自由采食燕麥干草，每周監測羔羊體重變化及臨床參數變化。當羔羊每天可以采食200 g干物質開食料時不再繼續增加開食料的量，并且所有羔羊在屠宰前7 d時均能每天采食200 g干物質開食料。不同直/支鏈淀粉比開食料配方依據湖羊開食料營養需要標準(NY/Y816-2004; 中華人民共和國農業部, 2004)設計(表1)。

1.2 樣品采集

羔羊56 日齡時，晨飼2 h后屠宰采樣，采集三部分腹囊部的瘤胃組織塊，并在冰的磷酸緩沖鹽溶液里清洗3次，一部分用鈍物將漿膜層和肌肉層分離得到瘤胃上皮，剪成約0.5 cm×0.5 cm的小碎塊置于液氮保存，用于RNA的提??；一部分修剪成1.0 cm×1.0 cm的組織塊置于4%多聚甲醛(Sigma，美國)溶液中用于組織形態學分析；一部分修剪成1.0 cm×1.0 cm的組織塊置于冰上用于瘤胃乳頭長度、寬度和個數的測定。

1.3 淀粉含量測定

開食料中總淀粉、直鏈淀粉和支鏈淀粉含量采用總淀粉試劑盒和直/支鏈淀粉試劑盒測定(Megazyme，愛爾蘭)。

1.4 瘤胃上皮形態學測定

放在冰上的瘤胃組織塊(1.0 cm×1.0 cm)當天用于測定瘤胃乳頭個數，然后每個樣品隨機選擇15個瘤胃乳頭用電子數顯游標卡尺(三豐，日本)測量每個瘤胃乳頭的長度和寬度。將固定在4%多聚甲醛的瘤胃組織做石蠟切片，蘇木精和伊紅染色，切片厚度為6 μm，用于瘤胃乳頭上皮各層厚度的測量。在進行組織形態學分析時采用盲檢的方法，在40×物鏡下選擇每個樣本的5個完整瘤胃乳頭進行測量。運用Image Pro Plus軟件進行測量，瘤胃上皮各層厚度的測量參照Steelo等[9]的方法。角質層定義為最外面的染色較重含有細胞質殘留物但沒有細胞核的細胞層；顆粒層為長軸型細胞，染色較淺并與棘狀層和基底層垂直；棘狀層和基底層沒有明顯的分界線將其定義為位于顆粒層和固有層之間的細胞層。

1.5 RNA的提取和cDNA的合成

瘤胃上皮總RNA的提取參照Chomczynski等[10]的方法。使用微量核酸蛋白測定儀(Thermo，美國)測定RNA的濃度和純度。所有樣品的吸收比例都為1.96～2.08， 證明RNA純度較高。 用1.4%的瓊脂糖膠檢測RNA的完整性。將所有的RNA濃度調整到0.5 μg·μL-1置于-80 ℃冰箱保存備用。利用含基因組RNA酶的反轉錄試劑盒(Takara生物，日本)進行cDNA的合成。

表1 開食料飼料成分和營養水平表 (干物質基礎) Table 1 Ingredient and nutrient composition of the starter diet (dry matter basis)

注：1預混料每kg飼糧提供：Zn 102 g，Mn 47 g，Cu 26 g，I 1140 mg，Se 500 mg，Co 340 mg，維生素A 17167380 IU，維生素D 858370 IU，維生素E 23605 IU；2該數值是基于NRC (2007)數據庫的計算值；3該數值是實際測量值。

Note：1Contained 102 g·kg-1of Zn, 47 g·kg-1of Mn, 26 g·kg-1of Cu, 1140 mg·kg-1of I, 500 mg·kg-1of Se, 340 mg·kg-1of Co, 17167380 IU·kg-1of vitamin A, 858370 IU·kg-1of vitamin D, and 23605 IU·kg-1of vitamin E;2Values were analyzed based on database of the NRC (2007);3The actual values for measurement.

1.6 引物的合成和實時定量PCR

利用Q5 Real-time PCR儀(Applied Biosystems，美國)對細胞周期蛋白、胰島素樣生長因子-1(insulin like growth factor，IGF-1)及內參基因GAPDH進行定量，GAPDH引物序列參照Wang等[11]的方法，實時定量PCR分析所用引物采用Primer 5.0軟件自行設計，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表2。SYBR購自Takara公司，反應條件為：95 ℃ 30 s預變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。反應體積20 μL：10.4 μL SYBR，10 μmol·L-1上下游引物各0.4 μL，2 μL樣品cDNA以及6.8 μL無菌水。所有樣品設3個重復。目的基因的相對表達量以管家基因GAPDH作為內參進行校正，數據分析采用2-ΔΔCT的方法。

表2 qRT-PCR基因引物序列Table 2 Primers for quantitative real time PCR

1.7 數據處理

結果以平均值±標準誤(means±SEM)進行表示。采用SPSS 20.0中的單因素方差分析(One-way ANOVA)進行顯著性分析，采用Turkey法進行多重比較。P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 生產性能及臨床癥狀觀察

所有羔羊在試驗期內未發生明顯的臨床癥狀。CS、MS和PS組羔羊的初生重[(3.31±0.11),(3.48±0.13),(3.35±0.12) kg，P=0.594]無顯著性差異，56日齡體增重[(11.56±0.69),(11.13±0.31),(10.29±0.40) kg，P=0.204]也無顯著差異。

2.2 斷奶前補飼不同直/支鏈淀粉比開食料對羔羊瘤胃乳頭形態的影響

3種不同直/支鏈淀粉比開食料顯著影響了羔羊瘤胃乳頭形態(表3)。CS組羔羊瘤胃乳頭長度和吸收表面積顯著(P<0.001)高于MS和PS組，CS和MS組羔羊瘤胃乳頭寬度顯著(P=0.001)高于PS組，3組羔羊瘤胃乳頭密度無顯著差異(P=0.114)。對瘤胃上皮各層厚度統計顯示，CS和PS組羔羊瘤胃上皮角質層厚度顯著(P=0.001)高于MS組；CS和MS組羔羊瘤胃上皮顆粒層厚度顯著(P<0.001)高于PS組；CS組羔羊瘤胃上皮棘基層厚度和總厚度顯著(P<0.001)高于MS和PS組。

2.3 斷奶前補飼不同直/支鏈淀粉比開食料對羔羊瘤胃上皮細胞周期蛋白mRNA表達量的影響

CS組羔羊瘤胃上皮細胞cyclinA(P=0.013)和CDK4(P=0.016)的mRNA表達量顯著高于PS組(圖1)，但和MS組無顯著差異；CS組羔羊瘤胃上皮細胞CDK2和CDK6的mRNA表達量顯著高于MS和PS組(CS>MS>PS，P<0.001)； CS組羔羊瘤胃上皮cyclinD1的mRNA表達量顯著(P=0.012)低于PS組，但和MS組無顯著差異；3組羔羊瘤胃上皮cyclinE的mRNA表達量無顯著差異(P=0.353)。

表3 斷奶前補飼不同直/支鏈淀粉比開食料對羔羊瘤胃上皮形態和各層厚度的影響Table 3 Effects of different amylose to amylopectin ratio in starter on papillae morphology and the thickness of different stratum of rumen epithelium in pre-weaned lambs

圖1 斷奶前補飼不同直/支鏈淀粉比開食料對羔羊瘤胃上皮細胞周期蛋白mRNA表達量的影響Fig.1 Effects of different amylose to amylopectin ratio in starter on cell cycle protein mRNA expression of rumen epithelium in pre-weaned lambs 不同字母表示平均值有顯著差異(P<0.05)。下同。Different letters are significantly different (P<0.05). The same below.

圖2 斷奶前補飼不同直/支鏈淀粉比開食料對羔羊瘤胃上皮IGF-1和IGF-1R的mRNA表達量的影響Fig.2 Effects of different amylose to amylopectin ratio in starter on the IGF-1 and IGF-1R mRNA expression of rumen epithelium in pre-weaned lambs

2.4 斷奶前補飼不同直/支鏈淀粉比開食料對羔羊瘤胃上皮IGF-1和IGF-1R的mRNA表達量的影響

CS組羔羊瘤胃上皮IGF-1的mRNA表達量顯著(P<0.001)高于MS和PS組(圖2)，CS和MS組羔羊瘤胃上皮IGF-1R的mRNA表達量顯著(P=0.001)高于PS組。

3 討論

3.1 斷奶前補飼不同直/支鏈淀粉比開食料對羔羊瘤胃乳頭形態的影響

瘤胃是反芻動物重要的消化器官，羔羊時期瘤胃的發育狀況對成年后的機體健康及生產性能具有重要影響[12]。Khan等[13]研究發現，與含有較高直鏈淀粉的燕麥(Avenasativa)和大麥相比，含有較低直鏈淀粉的小麥和玉米淀粉開食料更能促進犢牛瘤胃乳頭的發育，主要包括增加瘤胃乳頭的長度和寬度。同樣，本研究發現，含有較低直鏈淀粉的木薯淀粉開食料組增加了羔羊瘤胃乳頭的長度、寬度和表面積。同時，切片結果顯示，木薯淀粉開食料顯著增加了羔羊瘤胃上皮角質層、顆粒層、棘基層和總上皮的厚度。以上結果表明，木薯淀粉開食料更好地刺激了羔羊瘤胃乳頭的發育。

3.2 斷奶前補飼不同直/支鏈淀粉比開食料對羔羊瘤胃上皮細胞周期蛋白mRNA表達量的影響

以上研究結果表明,飼喂含有較高支鏈淀粉的木薯淀粉開食料顯著促進了羔羊瘤胃上皮的發育。為了研究木薯淀粉開食料促進瘤胃上皮發育的機制，對瘤胃上皮細胞周期蛋白和相關依賴性激酶的mRNA表達量進行分析。細胞周期是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程，主要包括靜止期(G0期)、分裂間期(G1、S和G2期)和有絲分裂期(M期)。細胞周期的推進主要受細胞周期蛋白(cyclins)及其相關激酶(cyclin dependent protein kinases, CDKs)的調控。本試驗研究發現木薯淀粉開食料顯著促進了瘤胃上皮cyclinE，CDK2，CDK4和CDK6的mRNA表達。研究表明，cyclinD1和cyclinE表達升高均能導致細胞周期G1期進程加快[14]。Filmus等[14]研究發現cyclinD1或cyclinD1-CDK4/CDK6復合物的表達升高有利于縮短大鼠小腸上皮細胞G1期的持續時間，推動細胞周期進程。Norbury等[15]也研究發現cyclinE通過與CDK2結合成復合體促進處于G1期的細胞向 S 期移行，cyclinE的表達越高其作用也越大。但是，本研究發現木薯淀粉組羔羊瘤胃上皮cyclinD1的mRNA表達量顯著較低，這與瘤胃上皮形態結果不相符，所以需要我們進一步在蛋白水平進行驗證。同時，本研究發現，木薯淀粉開食料組羔羊瘤胃上皮cyclinA的mRNA表達量較高。研究表明，cyclinA在S階段和G2/M階段發揮重要作用[16]，cyclinA-CDK2復合物使關鍵DNA復制因子磷酸化驅動染色體的復制[17]。Girard等[18]也提出，cyclinA在控制哺乳動物細胞的DNA復制中起主要作用。以上研究結果顯示，木薯淀粉通過促進羔羊瘤胃上皮細胞周期蛋白和相關依賴性激酶的表達，推動了細胞周期循環，進而促進了羔羊瘤胃上皮發育。

3.3 斷奶前補飼不同直/支鏈淀粉比開食料對羔羊瘤胃上皮細胞IGF-1和IGF-1R的mRNA表達量的影響

研究表明，細胞周期蛋白的表達受較多因素的影響，例如：IGF-1，上皮調節因子等。IGF-1作為有絲分裂原刺激劑，在和受體結合后可以激活下游信號通路，促進哺乳動物細胞增殖以及機體、器官、組織的生長發育。Lu等[19]體外研究發現，IGF-1可促進瘤胃上皮細胞cyclins的表達。Shen等[20]研究發現，山羊飼喂高能量飼料可以刺激瘤胃上皮IGF-1的表達，進而刺激瘤胃上皮的發育。本研究發現，木薯淀粉開食料組羔羊瘤胃上皮IGF-1及IGF-1R的mRNA表達量顯著升高。這可能是由于木薯淀粉在瘤胃中降解率較高，產生的能量較高，刺激了瘤胃上皮IGF-1的表達。所以，木薯淀粉開食料可能是通過IGF-1信號途徑，加速了細胞周期進程，進而促進了羔羊瘤胃上皮的發育。

4 結論

含有較高支鏈淀粉(木薯淀粉)開食料在瘤胃中較易發酵生成VFA，促進了瘤胃上皮IGF-1及細胞周期蛋白mRNA的表達，增加了斷奶前羔羊瘤胃乳頭的長度、寬度和表面積。研究結果為制訂羔羊營養方案具有重要指導意義。