四川南充地區1 056例地中海貧血初篩陽性樣本的基因診斷結果分析

杜利君，邢晏，蔣興亮，張兵，李欣， 楊杉，趙佳，何玉霞

(1.川北醫學院第二臨床學院·南充市中心醫院檢驗科；2.西華師范大學數學與信息學院；3.川北醫學院附屬醫院檢驗科，四川 南充 637000)

地中海貧血(thalassemia，地貧)，是由于基因缺陷引起珠蛋白合成缺乏或不足而導致的一種慢性溶血性貧血，屬于常染色體不完全顯性遺傳性疾病，以α、β-地貧最多見。不同地區、不同種族人群地貧基因的發生頻率、基因類型和分布特征具有明顯的差異，主要在地中海的中部、東部、東南亞地區流行，中國大陸主要分布在廣東、廣西、海南以及周邊省份，如湖南、福建、四川、云南、貴州等地區[1]。地貧輕型可無臨床表現，但重型可致殘、致死，嚴重威脅著人類的生命健康。因此，了解本地區人群的地貧基因突變類型和分布特征是預防及避免重型地貧患兒出生的工作重點。目前，各地關于地貧的基因類型和分布情況均有研究和分析，但四川南充地區地貧相關報道較少，故現對2015年7月至2017年7月在南充市中心醫院檢測的1 056例地中海貧血基因診斷結果進行分析，以了解南充地區人群中α、β-地中海貧血的基因類型和分布情況，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2015年7月至2017年7月在本院進行地中海貧血基因檢測的人員，患者的住址為南充地區覆蓋的三區、六縣，排除其它市區就診人員；且受檢者紅細胞平均體積(MCV)<80 fl和(或)紅細胞平均血紅蛋白(MCH)<27 pg，且已排除缺鐵性貧血的高度可疑地貧人群。其中，男性369例，女性687例；年齡1 d～81歲，平均年齡(22±16)歲；按年齡分為兒童組(0～17歲)324例，青中年組(18～50歲)648例，老年組(>50歲)84例。

1.2 主要儀器和試劑

Life Express Thermal Cycler PCR儀由杭州生物科技有限責任公司提供，HB-2012A核酸分子雜交儀，α、β地中海貧血基因檢測試劑盒(PCR+導流雜交法)由廣東凱普生物科技股份有限公司提供，檢測人抗凝靜脈血樣本中3種缺失型α-地貧(--SEA、-α3.7和-α4.2)、3種突變型α-地貧(CS、QS、WS)及β-地貧的17種突變位點CD17(A→T)、CD41-42(-TCTT)、IVS-II-654(C→T)、-28(A→G)、-29(A→G)、CD43(G→T)、CD14-15(+G)、CD71-72(+A)、CD27-28(+C)、CD31(-C)、IVSI-1(G→A/T)、IVSI-5(G→C)、βE3(G→A)、CAP(A→C或-AAAC)、Int(T→G)、-30(T→C)、-32(C→A)。

1.3 檢測方法

1.3.1 DNA分離提取 采用凱普血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，嚴格按照說明書提取樣本DNA。

1.3.2 PCR擴增 將α、β PCR mix與Taq酶按要求混勻后，取45 μL分裝到0.2 mL PCR管中；向已分裝反應液的PCR管中加入5 μL DNA模板，瞬時離心后，上機擴增。

1.3.3 擴增產物的導流雜交 嚴格按照凱普的雜交試劑盒說明書進行檢測。

1.3.4 結果判斷 根據試劑盒提供的地貧基因檢測結果分析圖比較分析判斷結果。

1.3.5 質量控制方案 地貧基因反向斑點雜交膜條可同時檢測3種α地貧缺失型基因(SEA、3.7、4.2)、3種突變型基因(CS、QS、WS)及17種常見β地貧突變型基因。(1)室內質控：雜交膜上有3個α和6個β正常對照點，每次實驗所有正常對照點均應顯色，突變純合子及缺失純合子除外，否則需重新提取DNA、PCR擴增、雜交。同時，為排除實驗過程出現污染，防止假陽性結果出現，使用蒸餾水作陰性質控，全程參與提取、擴增、雜交，陰性質控結果無任何雜交點，視為實驗過程無污染。此外，將已知地貧型別的陽性標本按照檢測樣本量分裝保存于-70 ℃，實驗時與檢測標本同步處理，全程參與提取、擴增、雜交，得到已知的地貧型別，視為該批地貧結果在控、可靠。(2)室間質評：本實驗室每年參加了衛生部組織的地中海貧血基因分型檢測的室間質評，成績均為100%。

1.4 統計學分析

數據采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，檢出率比較用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四川南充地區人群的地貧基因診斷結果

經多聚酶鏈擴增(GAP-PCR)技術和DNA芯片反向斑點雜交檢測技術，在1 056例地中海貧血基因檢測樣本中，共檢出α、β-地貧330例，檢出率為31.3%。其中，α-地貧168例(15.9%)，β-地貧161例(15.3%)，αβ復合突變1例(0.1%)。

2.1.1 α地貧基因類型及構成比 在330例確診地貧樣本中α-地貧168例，構成比為50.9%，包含6種亞型：--SEA/αα、-α4.2/αα、-α3.7/αα、-ααCS/αα、-ααQS/αα、--SEA/-a3.7。其中以--SEA/αα(72.6%)、-α3.7/αα(17.9%)為主，占α-地貧的90.5%。α-地貧的基因診斷結果及臨床分型的詳細情況(表1)。

2.1.2 β地貧基因類型及構成比 在330例地貧確診樣本中檢出β-地貧161例，構成比為48.8%，有以下6種類型：CD17、CD41-42、-28、-29、IVS-II 654、CD41-42/-29，其中最常見的3種突變類型為：CD17(50.3%)、CD41-42(31.1%)及IVS-II 654(14.3%)，占β-地貧的95.7%。β-地貧基因型及構成比詳細情況(表2)。

2.1.3 α復合β地貧基因類型 330例地貧患者中有1例α復合β-地貧，所占比例為0.3%，基因型為-α3.7/αα復合βIVS-II-654M，臨床表現為輕型。

表1 168例患者α-地貧基因型及構成比

表2 161例患者β-地貧基因型及構成比

2.2 患者地貧基因診斷結果比較

1 056例受檢者中，男性369例，檢出地貧90例(24.4%)，女性687例，檢出地貧240例(34.9%)，女性地貧基因檢出率明顯高于男性，差異具有統計學意義(χ2=12.423，P=0.001)；男性檢出α-地貧48例(13.0%)，女性檢出α-地貧120例(17.5%)，男女α-地貧檢出率無統計學差異(χ2=3.568，P=0.059)；男性β-地貧檢出42例(11.4%)，明顯低于女性119例(17.3%)，差異具有統計學意義(χ2=6.554，P=0.010)。男女α、β-地貧基因診斷情況(表3)。

2.3 各年齡組地貧基因診斷結果比較

1 056例樣本中，兒童組(0～17歲)324例，檢出地貧93例(28.7%)；青中年組(18～50歲)648例，檢出地貧213例(32.8%)；老年組(>50歲)84例，檢出地貧24例(28.6%)。各年齡組地貧基因檢出率差異無統計學意義(χ2=2.050，P=0.359)(表4)。

表3 患者α、β-地貧基因診斷結果

表4 各年齡組α、β-地貧基因診斷結果

3 討論

地中海貧血是我國南方地區最常見的遺傳性疾病之一，臨床以α和β地中海貧血較為常見。根據其基因型及臨床癥狀分為輕型、中間型和重型[1]。目前，中重癥地中海貧血的治療較困難，主要有輸血、造血干細胞移植和基因治療等方式，給家庭和社會帶來了沉重的負擔。地貧雖然難治但可以預防，因此，了解本地區人群的地貧基因突變類型和分布特征率是預防及避免中重型地貧患兒出生的工作重點，對地貧的防治具有重要意義。

在本研究納入的1 056例地貧基因受檢者中，攜帶者330例，檢出率為31.3%，明顯高于成都[2]、遂寧[3]、瀘州[4]等四川其它地區，可能與研究納入的對象和數量有一定的關系。本研究納入的1 056例受檢者，其紅細胞平均體積(MCV)<80 fl和(或)紅細胞平均血紅蛋白(MCH)<27 pg，且已排除缺鐵性貧血的高度可疑地貧人群，因此可能增加了本地區的地貧檢出率，提示南充地區可能屬于地貧高發地區之一，應進一步加強地中海貧血的篩查和基因診斷。在330例地貧患者中，α地貧患者168例(15.9%)，以--SEA/αα(72.6%)、-α3.7/αα(17.9%)為主，占α-地貧的90.5%。其α地貧基因型分布與廣東、廣西、湖南、四川、重慶等地區人群基本一致[5-7]。另外β地貧檢出161例(15.3%)，以CD17(50.3%)、CD41-42(31.1%)及IVS-II 654(14.3%)，為主，占β地貧的95.7% ，與重慶、四川地區的β地貧主要基因突變類型一致[7-8]。但廣東、廣西地區的β地貧以CD41-42(-TCTT)為主[5,9]，提示不同地域、不同人群的β地貧基因突變類型存在差異。此外，本研究還檢出αβ復合地中海貧血1例(0.1%)。研究表明，αβ復合突變的患者臨床癥狀有所減輕，但若其與α地貧或β地貧婚配，均有可能生育中型和重型地貧患兒[10]。因此，若夫妻中任意一方為αβ復合突變時，另一方需檢測α和β地貧基因，以減少或避免生育中型和重型地貧患兒。此外，該檢測方法尚存在一定的局限性，實驗中檢測的3個a缺失、3個a突變以及17個b突變位點，為臨床最常見地貧類型，覆蓋95%以上地貧類型，但地貧基因的突變類型較多，無法完全覆蓋，可能存在少見地貧類型的漏檢。

在受檢人群中，女性的地貧檢出率為34.9%，明顯高于男性地貧檢出率為24.4%，與自貢[11]、黔東南州[12]等地區研究基本一致，但與重慶[13]地區男、女地貧檢出率存在差異。地貧以預防為主，尤其是對育齡夫婦的預防顯得尤為重要。本研究納入的育齡女性占有較大比例，若育齡夫妻中的女方是地貧攜帶者，部分男性若血液學指標MCV>80 fl和MCH>27 pg，則未進行地貧基因的檢測，有可能存在漏檢的情況；亦有部分夫妻，即便女方為地貧攜帶者，而男方由于各種原因未接受地貧的相關檢查，此外，隨著二胎政策的出臺以及臨床醫護人員不斷加大地貧知識地宣傳力度，孕婦增加了安全意識及對地貧的重視程度，進行地貧基因檢測的孕婦也相應增多。以上均是造成女性檢出率高于男性檢出率的重要因素。同時，亦不能排除因為樣本含量較小造成的性別差異。雖然各年齡組的地貧基因檢出率未發現差異，但由于二胎政策的開放，青中年為生育年齡的集中段，所以加大對青中年人群，尤其是育齡夫婦的地貧篩查和基因診斷力度，對提高人口素質具有重要作用。

綜上，南充地區是地中海貧血高發地區之一，α地貧以--SEA/αα缺失最常見，β地貧以CD17最常見，CD41-42次之，具有明顯的地域差異。通過對南充地區地貧基因突變類型和分布特征的研究，為南充地區制定地貧防治計劃、開展臨床咨詢、干預出生缺陷以及臨床診療提供參考依據。