僵蠶兩種入藥形式下的化學成分溶出性能與抗驚厥作用比較

程雪嬌 胡美變 劉玉杰 肖禾 吳純潔

中圖分類號 R284.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）09-1242-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.09.21

摘 要 目的：對僵蠶煎液和粉末沖服兩種入藥形式下化學成分溶出性能與抗驚厥作用的差異性進行研究，為僵蠶入藥方式的選擇提供參考。方法：測定僵蠶煎液和粉末仿生胃液的干浸膏得率，采用高效液相色譜法測定僵蠶煎液和粉末仿生胃液中草酸銨的含量，采用二喹啉甲酸法測定僵蠶煎液和粉末仿生胃液中蛋白質含量。取小鼠按隨機數字表法分為正常組（1%羧甲基纖維素鈉溶液）、模型組（1%羧甲基纖維素鈉溶液）、陽性組（苯妥英鈉，2 mg/kg）以及僵蠶煎液和粉末混懸液的高、中、低劑量組（以生藥計分別為0.75、1.5、3 g/kg），每組20只；灌胃給藥60 min后給予小鼠電刺激，記錄小鼠驚厥率。結果：僵蠶煎液與粉末胃液溶液的干浸膏得率分別為22.08%、26.40%（P<0.05），草酸銨含量分別為11.22%、16.83%（P<0.05），蛋白質含量分別為3.39%、4.92%（P<0.01）。與正常組比較，模型組小鼠驚厥率顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠的驚厥率均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且僵蠶粉末混懸液組小鼠驚厥率均低于同劑量煎液組。結論：僵蠶粉末仿生胃液中化學成分的溶出性能優于煎液，且僵蠶粉末抗驚厥效果較煎液好。

關鍵詞 僵蠶；粉末；煎液；干浸膏得率；草酸銨；蛋白質

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the difference of dissolution performance of chemical component and anticonvulsant effect of Bombyx mori decoction and powder taken with water， and to provide reference for the selection of application forms of B. mori. METHODS： The yield of dry extract was determined for decoction and powder biomimetic gastric juice of B. mori. HPLC method was used to detect the content of ammonium oxalate in decoction and powder biomimetic gastric juice of B. mori. The content of protein in decoction and powder biomimetic gastric juice of B. mori was determined with bicinchoninic acid （BCA） method. Mice was divided into normal group （1%Sodium carboxymethylcellulose solution）， model group （1%Sodium carboxymethylcellulose solution）， positive group （phenytoin， 2 mg/kg） and B. mori decoction and powder suspensions high-dose， medium-dose and low-dose groups （0.75， 1.5， 3 g/kg by crude drug） according to random number table， with 20 mice in each group. After 60 min of intragastric administration， electric stimulation was conducted， and the rate of convulsion in mice was recorded. RESULTS： The yields of dry extract were 22.08% and 26.40% in decoction and powder gastric juice of B. mori （P<0.05）； the contents of ammonium oxalate were 11.22% and 16.83% （P<0.05）， and the contents of protein was 3.39% and 4.92% （P<0.01）. Compared with normal group， convulsion rate of mice was increased significantly in model group （P<0.01）； compared with model group， convulsion rates of mice were decreased significantly in administration groups （P<0.05 or P<0.01）， and the convulsion rate of mice in B. mori powder suspensions group was lower than decoction group. CONCLUSIONS： The dissolution performance of the chemical component from gastric juice of B. mori powder is better than that of decoction， and the anticonvulsant effect of B. mori powder is better than decoction.

KEYWORDS Bombyx mori； Powder； Decoction； Yield of dry extract； Ammonium oxalate； Protein

僵蠶又名白僵蠶，為蠶蛾科昆蟲家蠶（Bombyx mori Linnaeus）4～5齡的幼蟲感染（或人工接種）白僵菌[Beauveria bassiana （Bals.） Vuillant]后致死的干燥體[1]，具有息風止痙、祛風止痛、化痰散結的功效，在臨床中主要用于治療肝風夾痰、驚癇抽搐、小兒急驚、破傷風、中風口、風熱頭痛等癥。在用法上，僵蠶歷代多以“粉”“末”入藥[2-3]，最具有代表性的有《雷公炮炙論》：“單搗，篩如粉用也”[2]，且在《本草綱目》《中藥大辭典》《中華本草》中收載了以僵蠶為主藥的單方或驗方達65首，均為直接服用細粉或入丸、入散劑[4-5]。而近代僵蠶多入煎劑[6-7]，入丸、入散劑的較少。僵蠶入煎劑味劣難服，易反胃敗胃，療效不穩定，限制了其在臨床上的應用。古代僵蠶研末沖服能否克服入煎劑的上述缺點，其在臨床上的應用是否科學、合理都亟待進一步考察。因此，本研究擬通過對比分析僵蠶煎液與僵蠶粉末2種入藥形式下的化學成分溶出性能（干浸膏得率、草酸銨和蛋白質含量）及其抗驚厥作用，為僵蠶入藥方式的選擇提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC2010A高效液相色譜儀、BP211D電子天平（德國賽多利斯公司）；ZRS-8G智能溶出儀（天津大學無線電廠）； TGL-16G高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；酶標儀（成都百樂科技有限公司）；JTC-1驚厥及痛覺實驗交流刺激器（成都儀器廠）。

1.2 藥材、藥品與試劑

僵蠶（批號：161007）由成都岷江源藥業股份有限公司提供，經成都中醫藥大學李敏教授鑒定為真品，經檢驗達到2015年版《中國藥典》（一部）標準；苯妥英鈉片（山西云鵬制藥有限公司，批號：A150902，規格：1 mg/片）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（揚州聯科生物技術有限公司，批號：7219101）；人工胃液（北京雷根生物技術有限公司，批號：0020A17）；草酸銨對照品（成都市科龍化工試劑廠，批號：2015030501，純度：>99.5%）；磷酸氫二銨（天津市瑞金特化學品有限公司，批號：2016070201）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

SPF級KM小鼠220只，鼠齡60 d，♀♂各半，體質量（20±2） g，購自成都達碩實驗動物有限公司，生產合格證號：SCXK（川）2013-24。實驗小鼠均飼養在成都中醫藥大學基礎醫學院動物房內，光照周期為12 h，室溫保持在25 ℃左右，實驗期間自由飲食，對小鼠的飼養遵守實驗動物管理與保護的相關規定。實驗前先將小鼠適應性喂養5 d。

2 方法與結果

2.1 僵蠶兩種給藥方式下化學成分的溶出性能比較

2.1.1 干浸膏得率 （1）樣品制備。僵蠶粉末：取僵蠶1 kg，60 ℃烘干2 h，粉碎后過100目篩，制得僵蠶粉末，置于干燥器中，備用。僵蠶煎液：稱取上述同批次僵蠶粉末適量，加入10倍量蒸餾水，煎煮2次，每次1 h，合并煎液，濾過，用旋轉蒸發儀濃縮至生藥量為0.1 g/mL，即得，置于冰箱中保存，備用。僵蠶粉末仿生胃液：參考文獻[8]，精密稱取上述同批次僵蠶粉末適量，加30倍量人工胃液，置于小杯中，設定智能溶出儀溫度為37 ℃、轉速為100 r/min，處理1 h，濾過，濃縮至生藥量為0.1 g/mL，即得?？瞻兹芤海喝∪斯の敢?50 mL，在不加入僵蠶的情況下按“僵蠶粉末仿生胃液制備”方法處理，即得。（2）干浸膏得率計算。分別取僵蠶煎液、僵蠶粉末仿生胃液和空白溶液各3份，每份50 mL，濃縮蒸干，稱定并記錄干浸膏質量，計算干浸膏得率：干浸膏得率（%）=（干浸膏質量-空白溶液的干浸膏質量）/僵蠶粉末質量×100%。經計算，僵蠶煎液、僵蠶粉末仿生胃液的平均干浸膏得率分別為22.08%、26.40%（n=3）。

2.1.2 草酸銨含量 （1）溶液制備。草酸銨對照品溶液：精密稱取干燥至恒質量的草酸銨對照品0.172 g，用磷酸氫二銨水溶液（5 g/L，pH 2.5）溶解，定容至100 mL量瓶中，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜抽濾，即得0.150 mg/mL的草酸銨溶液。樣品溶液：精密吸取“2.1.1”項下僵蠶煎液0.5 mL，置于10 mL試管中，75 ℃水浴加熱5 min，滴加0.25 mol/mL的CaCl2溶液至沉淀完全，冷卻至室溫，以離心半徑為8 cm、3 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用磷酸氫二銨水溶液（5 g/L，pH 2.5）超聲處理（功率：20 W，頻率：20 kHz）30 min，轉移至250 mL量瓶中，定容，用0.45 μm的微孔濾膜抽濾，即得供試品溶液；同法取僵蠶粉末胃液和空白溶液制備相應樣品溶液。（2）色譜條件。色譜柱：Phenomenex Gemini C18；流動相：磷酸氫二銨水溶液（5 g/L，pH 2.5）；流速：0.5 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：214 nm；進樣量：10 μL。（3）線性關系考察。精密吸取“2.1.2（1）”項下草酸銨對照品溶液，用超純水稀釋制成不同質量濃度（15、30、60、90、120、150 μg/mL）的草酸銨對照品溶液，按照“2.1.2（2）”項下的色譜條件進樣，記錄峰面積。以草酸銨對照品溶液質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，得回歸方程為y=3 507.93x+15 916（R2=0.999 0）。結果表明，草酸銨質量濃度在15～150 μg/mL范圍內線性關系良好。（4）方法學考察。按照相關方法操作進行方法學考察。結果，精密度、穩定性、重復性試驗中草酸銨峰面積的RSD分別為0.78%、1.73%、2.47%（n=6），準確度試驗中草酸銨的平均加樣回收率為98.65%（RSD=1.2%，n=6）。（5）樣品含量測定。分別精密吸取各樣品溶液，按照“2.1.2（2）”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，將各峰面積代入回歸方程，計算各樣品溶液中草酸銨含量。采用SPSS 19.0統計軟件進行成組t檢驗。結果，僵蠶煎液、僵蠶粉末仿生胃液中草酸銨含量分別為11.22%、16.83%（n=3），兩組間比較差異具有統計學意義（P<0.05）。

2.1.3 蛋白質含量 （1）溶液的制備。樣品溶液：精密吸取“2.1.1（1）”項下僵蠶煎液2 mL，以離心半徑為4 cm、12 000 r/min離心5 min，分取上清液，將上清液加水定容至100 mL[9]，即得僵蠶煎液的樣品溶液；同法制得僵蠶粉仿生胃液的樣品溶液?？瞻讓φ杖芤海壕芪∪斯の敢?0 mL，濃縮至10 mL，精密吸取濃縮液2 mL，在不加入僵蠶的情況下前述方法同法制備空白對照溶液。標準蛋白溶液：取適量牛血清白蛋白（BSA）標準品，用超純水稀釋制成不同質量濃度（0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL）的標準品溶液。（2）線性關系考察。精密吸取上述不同質量濃度的標準品溶液，按BCA試劑盒方法操作，采用酶標儀測定562 nm波長處的吸光度值，以標準品溶液質量濃度為橫坐標（x）、吸光度為縱坐標（y）進行線性回歸，得回歸方程為y=585.76x-80.188（R2=0.991 2）。結果表明，蛋白質質量濃度在0～500 μg/mL范圍內線性關系良好。（3）BCA回收試驗。精密稱取6份已知含量的樣品溶液，分別加入一定量200 μg/mL標準品溶液，按照上述操作方法，進行回收試驗測定。結果，標準蛋白的平均回收率為99.05%（RSD=1.70%，n=6）。（4）樣品中蛋白質含量測定。分別精密吸取“2.1.3（1）”項下樣品溶液和空白對照溶液各3份，每份20 μL，按BCA試劑盒方法測定吸光度，并計算樣品溶液的實際吸光度（即樣品溶液平均吸光度-空白溶液平均吸光度），代入“2.1.3（2）”項下回歸方程，計算樣品溶液的蛋白質濃度，并采用SPSS 19.0統計學軟件進行成組t檢驗。結果，僵蠶煎液、僵蠶粉末仿生胃液中蛋白質含量分別為3.39%、4.92%（n=3），差異具有統計學意義（P<0.01）。

2.2 僵蠶兩種入藥形式下對小鼠的抗驚厥作用比較

采用最大電休克實驗。用兩個耳電極夾住小鼠雙耳尖部，在JTC-1驚厥及痛覺實驗交流刺激器上設定參數為50 V、0.3 s，單次刺激，以出現后肢強直性伸直為合格小鼠，共篩選出180只。將180只合格小鼠按隨機數字表法分為9組，每組20只（♀♂各半），分別為正常組（1%羧甲基纖維素鈉溶液，5 mL/kg），模型組（1%羧甲基纖維素鈉溶液，5 mL/kg），陽性組（苯妥英鈉，2 mg/kg），僵蠶煎液高、中、低劑量組（以生藥量計分別為3、1.5、0.75 g/kg）和僵蠶粉末混懸液高、中、低劑量組（以生藥量計分別為3、1.5、0.75 g/kg）[10]。灌胃給藥后60 min，按上述電刺激參數給予電刺激，以小鼠后肢強直性抽搐作為強直性驚厥指標，記錄驚厥鼠數，計算各組小鼠的驚厥率。采用SPSS 19.0統計軟件對驚厥率結果進行χ2檢驗，結果見表1。

由表1可知，與正常組比較，模型組小鼠驚厥率顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠的驚厥率均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且僵蠶粉末混懸液組小鼠驚厥率均低于同劑量僵蠶煎液組。

3 討論

本研究基于古方中僵蠶粉末的應用理論，對僵蠶煎液與粉末沖服兩種入藥方式下的化學成分溶出性能（干浸膏得率、草酸銨和蛋白質含量）和抗驚厥作用進行了比較，將僵蠶藥用物質基礎與藥效相結合，綜合分析了僵蠶煎液和粉末沖服兩種入藥方式的效能差異。針對僵蠶部分藥效物質未知的特點和物質基礎整體特征，采用半仿生酶法（在半仿生提取法的基礎上，加入合適的酶，模擬胃環境）模擬僵蠶粉末在胃環境中的溶出過程，測定干浸膏得率，該指標能較準確地反映藥物整體物質基礎[11-12]。已有研究表明，僵蠶含有蛋白質、草酸銨、多糖、酶以及少量核苷酸等成分，其中蛋白質為主要化學成分，草酸銨具有抗驚厥作用[13]。因此，本研究將干浸膏得率以及草酸銨、蛋白質含量作為兩種入藥方式的化學成分差異化評價指標科學、合理?，F代研究表明，僵蠶具有抗驚厥作用[14]，并且最大電休克發作模型為常用經典急性驚厥模型。因此，本研究采用最大電休克實驗考察兩種入藥方式的抗驚厥作用差異。

本研究結果表明，僵蠶粉末仿生胃液的干浸膏得率、草酸銨含量以及蛋白質含量均顯著高于僵蠶煎液?？梢?，同煎液相比，僵蠶以粉末沖服入藥能較好地保證其化學成分的溶出，尤其是部分有效成分的溶出，為發揮相應藥效作用奠定了物質基礎；相反，僵蠶以煎液入藥，高溫可能會導致部分有效成分被破壞或干浸膏得率下降，不利于其藥效的發揮。本研究還發現，與煎液相比，僵蠶粉末抗驚厥作用更好，這可能與僵蠶粉末沖服的化學成分溶出性能較煎液強有關。由此可見，僵蠶以粉末沖服入藥治療驚厥，在劑型的選擇上具有一定的科學性。但僵蠶入藥形式的差異可能會導致其藥效發生改變，考慮到僵蠶的活性成分也可能有一定的毒性，因此，在臨床應用實踐中，在不同的入藥方式下均需要對其活性成分（如蛋白質、草酸銨）含量進行限度控制，僵蠶粉末的臨床劑量將在以后的研究中進一步探討。另外，由于僵蠶粉末入藥療效受多種因素的共同影響，故未來仍需對僵蠶的藥動學特征等進行系統研究。

參考文獻

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（收稿日期：2017-09-05 修回日期：2017-11-28）

（編輯：林 靜）