重復經顱磁刺激對甲基苯丙胺誘導的大鼠條件性位置偏愛復吸行為的作用

武學慶，居云悅 ，焦東亮 ，趙敏,*

1．引言

甲基苯丙胺，俗稱冰毒，屬于苯丙胺類興奮劑（Amphetamine-type stimulants, ATS），是一類成癮性的神經興奮物質[1-2]。這類精神活性物質具有成癮性及嚴重的神經毒性[3-4]，對國家、社會、家庭及個人造成嚴重的不良影響和經濟負擔，是當今醫學界面臨的新挑戰。因此，研發行之有效的治療方法至關重要。

rTMS是基于電磁感應原理在大腦中形成電場的一種神經刺激和神經調節技術，其形成的磁場能夠無衰減地穿透顱骨進入大腦皮層，使大腦皮層的局部電活動發生變化，從而發揮治療效果[5]。大量研究表明，rTMS能夠治療多種嚴重的神經精神疾病，如精神分裂、抑郁、中風、帕金森、癲癇等，其原因可能與rTMS能夠調節大腦皮層的興奮性，改變突觸結構及神經元可塑性，調節腦內神經遞質的釋放以及促進神經再生等有關[6-8]。

近年來，研究人員開始應用rTMS對藥物成癮的治療作用進行相關探索。臨床研究發現：rTMS可以有效減輕成癮者對海洛因、尼古丁、可卡因和酒精等的渴求程度。如Shen等人用高頻（10Hz）rTMS刺激海洛因成癮者左側DLPFC，發現成癮者對海洛因的渴求降低[9]；Prip fl等人同樣應用10Hz的rTMS對尼古丁成癮者左側DLPFC進行刺激，結果發現rTMS能降低患者對尼古丁的渴求[10]；Terraneo等的研究應用rTMS（15Hz）刺激可卡因成癮者左側DLPFC，能降低患者對可卡因的渴求[11]；Mishra等應用rTMS（10Hz）刺激酒精成癮者刺激右側DLPFC，發現rTMS也能減輕酒精成癮者的渴求[12]。同時動物研究還發現：用rTMS（20Hz）刺激嗎啡戒斷大鼠額葉時，伏隔核腦區的多巴胺釋放水平顯著增加[13]。而Li等人應用低頻（1Hz）rTMS刺激甲基苯丙胺成癮者DLPFC區，發現低頻刺激能夠增加成癮者對甲基苯丙胺的心理渴求[14]。這些研究提示高頻rTMS對藥物成癮可能具有潛在的治療作用。

目前國內外關于rTMS治療甲基苯丙胺成癮的研究很少，rTMS對甲基苯丙胺成癮的作用尚且不明。因此本研究應用甲基苯丙胺誘導的大鼠條件性位置偏愛模型，結合rTMS技術，探索高頻rTMS對甲基苯丙胺成癮的作用，為日后臨床上應用rTMS治療甲基苯丙胺成癮提供初步的理論依據。

2．實驗材料和方法

2.1 實驗動物

我們使用雄性SD（Sprague Dawley）大鼠進行實驗。大鼠重250 (100)g，n=70，其中，17只用于建立CPP復吸模型（Con: n=6; METH 1: n=6; METH 2: n=5），27只用于實驗一(SAL: n=7; METH + sham:n=10; METH + rTMS: n=10)，26只用于實驗二（SAL:n=7; METH + sham: n=9; METH + rTMS: n=10）。由中國科學院上海藥物研究所動物實驗中心提供，飼養環境為恒溫（23 ± 2 ℃），濕度50%，自由進食、進水，12 h光暗循環。所有實驗操作均嚴格遵循實驗動物管理委員會批準的《實驗動物研究方案》。

2.2 藥品試劑

甲基苯丙胺：中國軍事科學院提供。

2.3 建立條件性位置偏愛復吸模型

CPP實驗器材購自上海吉量。條件位置偏愛箱為兩個大小相同的條紋箱，尺寸：40 cm*40 cm*60 cm，中間隔著一塊可移動的板子，能使大鼠在兩箱之間自由穿梭。兩側條紋箱肉眼可辨：其中一側箱子的圖案由水平黑白相間的條紋組成；而另一側箱子是垂直黑白相間的條紋。

實驗主要分為三大階段：大鼠條件性位置偏愛行為的形成、消退和復吸。

我們首先建立大鼠條件性位置偏愛實驗。條件性位置偏愛實驗主要分為四個階段：適應期（Habituation）， 條 件 化 前 期 (Preconditioning Test)， 條 件 化 期 (Conditioning)和 測 試 期 (Postconditioning/Post-training Test)。在適應期，封閉中間隔板，使大鼠分別適應兩個條紋箱的環境，左右兩邊各30 min，適應間隔6 h；條件化前期，即預跑期，中間隔板打開，使大鼠自由穿梭在兩條紋箱之間，時間為15 min，分別記錄大鼠在兩箱中的停留時間；條件化期為期四天，將大鼠分成生理鹽水對照組（Con）和CPP模型組（METH 1與METH 2），根據預跑階段記錄的時間結果，將兩側箱子分為偏愛箱與非偏愛箱，其中大鼠停留時間較長的那一側為偏愛箱，另一側為非偏愛箱,并將非偏愛側箱子作為藥物配對箱。在CPP模型組，每日上午給予每只動物腹腔注射生理鹽水（1 mg/kg），注射后立即放入偏愛箱中，用隔板封閉通道，觀察45分鐘后取出放回籠中；隔6 h后腹腔注射一次METH（1 mg/kg），注射藥物后立即放入藥物配對箱內，用隔板封閉通道，觀察45分鐘后取出。連續訓練4天，共注射4次METH和4次生理鹽水。生理鹽水組僅注射生理鹽水。第四階段為測試期，將實驗鼠放入箱子內，打開中間隔板，使大鼠在兩個箱子間自由活動15分鐘，記錄大鼠在每個箱子的停留時間。CPP分數是測試期在非偏愛側的停留時間減去預跑期在非偏愛側的停留時間。

成功建立起大鼠的CPP行為后，對大鼠進行消退訓練（Extinction）。消退方式類似條件化期，將原本注射METH的那一側，改為注射生理鹽水（1 mg/kg）并放入非偏愛箱進行消退訓練，連續訓練4天后進行消退測試（Extinction Test）。

最后，大鼠的偏愛行為消退后，采用藥物誘發的方式進行復吸測試(Reinstatement Test)，即在測試之前對模型組大鼠腹腔注射0.5 mg/ml的甲基苯丙胺。

研究表明1mg/kg的METH能夠建立穩定持久的CPP模型[15-16]，并且此濃度進行條件配對的CPP模型，在CPP行為消退后可用0.5 mg/ml的甲基苯丙胺成功誘發復吸行為[17-18]。

2.4 實驗設計

為了探索急慢性rTMS對METH誘導的條件性位置偏愛復吸行為的影響，我們設計了兩個實驗：

實驗一：探索急性高頻（10Hz）rTMS對大鼠CPP復吸的影響。將大鼠隨機分成三組：(1) SAL組：生理鹽水對照組；(2) METH + sham組（偽刺激組），CPP行為發生消退后，給予大鼠為期1天的偽刺激處理；(3) METH + rTMS組（真刺激組），CPP行為發生消退后，給予大鼠為期1天的真刺激處理。刺激結束后24 h，進行復吸測試。

實驗二：探索慢性高頻（10Hz）rTMS對大鼠CPP復吸的影響。將大鼠隨機分成三組：SAL組、METH + sham組和METH + rTMS組，在CPP行為發生消退后，對METH + sham組進行為期3天的偽刺激處理，而對METH + rTMS組進行為期3天的真刺激處理。刺激結束后24 h，進行復吸測試。

刺激參數及真假刺激方式見下文。兩次實驗的條件都是對照嚴格一致的，實驗大鼠數量、體重、生理鹽水對照組、實驗流程、實驗環境等都是嚴格一致的。也就是說，兩次實驗，除了最后rTMS的刺激天數不同，其余均在同一條件下進行。

2.5 rTMS儀器與刺激方案

rTMS刺激儀器和線圈購自武漢依瑞德公司，其中線圈內徑2.5 cm，外徑5 cm。在實驗中，急慢性rTMS刺激均是每日進行兩次刺激，上下午各一次，每次給予500個刺激，中間間隔6 h，每日共計1000個刺激數。其中，刺激頻率為10 Hz，刺激串為20，串刺激數為25，串間隔為15 s。刺激強度均為30%最大輸出功率，相當于100% RMT。真刺激組大鼠在刺激時，使線圈中心緊貼頭皮，對準大鼠顱骨頂；而假刺激組的線圈置于大鼠頭頂上8 cm，確保大鼠能夠感受到線圈的噪音但不會接收到磁場刺激。在刺激期間，用手固定大鼠，限制其運動。另外，為了排除刺激時的噪音及固定方式對大鼠產生應激反應，在實驗開始前，我們每天對大鼠進行12 min的rTMS假刺激，連續刺激1周，使大鼠適應rTMS的操作程序。實驗期間，rTMS真假刺激均不會導致大鼠發生癲癇或其他明顯的行為異常。

2.6 數據分析與統計

實驗數據采用prism 6.0 軟件進行統計分析，應用雙因素方差分析（two-way ANOVA)、Bonferroni post hoc多重比較檢驗對數據進行統計。p < 0.05代表有統計學差異。結果以均值（標準誤）的形式呈現。

3．結果

3.1 0.5mg/ml的甲基苯丙胺能夠成功誘發大鼠CPP的復吸行為

實驗流程如表1所示，將實驗大鼠隨機分成3組：Con組(n=6)，METH 1組(n=6) 和METH 2組(n=5)，各組處理情況見圖2A。

各組CPP得分及統計結果如表2a和表2b所示。研究表明，應用劑量為1 mg/ml的METH進行條件化訓練，能夠成功建立起甲基苯丙胺誘導的條件性位置偏愛模型，經過消退訓練后，腹腔注射0.5 mg/ml 的METH能夠成功誘發大鼠的復吸行為（圖2B），METH 2 vs. Con, t (42) = 3.31, p = 0.006; 而生理鹽水則不能誘發，METH 1 vs. Con, t (42) = 0.79, p >0.999。

3.2 急性rTMS不能顯著抑制CPP的復吸行為

各組大鼠在三次測試中的CPP得分及統計結果如表3a和表3b所示。結果表明，在大鼠的條件性位置偏愛行為發生消退后，給予1天的rTMS處理，能夠在一定程度上抑制成癮大鼠的復吸行為，但差異沒有統計學意義（圖3C），METH + rTMS vs.METH + sham, t (72) = 1.48, p = 0.431。

說明急性rTMS對成癮大鼠的復吸行為可能具有一定的抑制作用，但是否有效需要進一步地探索。

3.3 慢性rTMS能夠顯著抑制CPP的復吸行為

各組大鼠在三次測試中的CPP得分及統計結果見表4a和表4b。結果提示，大鼠的條件性位置偏愛行為發生消退后，連續給予3天的rTMS處理，能夠抑制成癮大鼠的復吸行為（圖4C）：METH+rTMS vs. SAL, t (69) = 0.63, p > 0.999; METH + rTMS vs. METH + sham, t (69) =3.33, p = 0.004。

表1．大鼠條件性位置偏愛復吸模型實驗流程

由此說明，慢性rTMS能夠抑制甲基苯丙胺成癮大鼠的復吸行為。

4．討論

4.1 主要發現

物質成癮目前被認為是一種病理性的學習記憶過程。成癮物質會使成癮者的大腦結構和功能發生改變，使得成癮者在戒斷期對藥物相關線索異常敏感，極易產生渴求，誘發復吸行為[19]。

條件性位置偏愛實驗是目前評價藥物精神依賴性的經典實驗模型，是一種基于巴普洛夫條件反射的學習記憶過程[20]。該成癮模型能夠很好地模擬現實中人的成癮情況，主要包括三大階段：成癮記憶的形成、消退和復吸。這種基于巴普洛夫條件反射形成的成癮性記憶非常牢固，而消退性記憶則較脆弱，因而在CPP消退后，當動物再次接觸藥物相關線索時，會很容易誘發出復吸行為[21]，如圖2所示。

大量研究表明，rTMS刺激大腦時，可以引起突觸可塑性的改變，表現為長時程增強（long-time potentiation, LTP） 和 長 時 程 抑 制 (long-time depression，LTD)。目前一些理論認為，rTMS的這種作用效果主要與刺激頻率和刺激強度密切相關，高頻刺激會誘發LTP，而低頻刺激則會誘發LTD[6,22]。而本研究在條件性位置偏愛行為發生消退后，對大鼠進行高頻rTMS刺激，結果發現慢性高頻rTMS能夠抑制成癮大鼠的復吸行為。這可能是因為高頻磁刺激誘發的LTP作用，增強了大鼠的消退性記憶，從而預防了復吸行為的發生。而急性高頻磁刺激雖然沒能成功抑制住大鼠的復吸行為，但與假刺激組相比，有一定的抑制趨勢。結合實驗一與實驗二，說明rTMS的這種抑制作用需要足夠的磁刺激量。

圖2．METH（0.5mg/ml）成功誘發大鼠條件性位置偏愛的復吸行為

表2a．CPP復吸模型，三組大鼠三次測試之間的比較

表2b．CPP復吸模型，各組大鼠CPP得分比較

圖3．急性rTMS處理對CPP復吸行為的作用

表3a．實驗一，三組大鼠三次測試之間的CPP得分比較

表3b．實驗一，各組大鼠CPP得分組內比較

圖4．慢性rTMS處理對CPP復吸行為的作用

表4a．實驗二，各組大鼠三次測試之間的CPP得分比較

表4b．實驗二，各組大鼠CPP得分組內比較

4.2 研究局限性

首先，本研究進行了一次復吸測試，如有可能，還可以往后每隔幾天再測一次，觀察rTMS刺激的持久性。其次，因實驗條件的局限性，一批實驗能做的大鼠數量有限，本來可以通過一次實驗來檢測急慢性rTMS對復吸行為的作用，但本研究分成了兩個實驗來探索。第三，本研究中rTMS刺激參數是通過參考多個實驗研究最終制定的。該研究目前僅僅探索了高頻磁刺激對CPP復吸行為的影響，但是其他刺激模式如低頻刺激等對復吸行為的作用還有待進一步探索。

4.3 研究意義

本研究分別探索了急慢性rTMS對甲基苯丙胺誘導的條件性位置偏愛復吸行為的影響，發現rTMS能夠抑制成癮的復吸行為，為日后臨床上應用rTMS治療物質成癮提供一個初步的理論基礎和依據。未來的研究可以結合臨床研究探索不同rTMS刺激模式對物質依賴的影響及其作用機制。

資金來源

國家重點研發計劃“重大慢性非傳染性疾病防控研究”（2017YFC1310400），國家自然基金聯合基金重點項目（U1502228），國家自然科學基金（81771436），上海市衛生計生委聯合攻關及適宜項目（2014ZYJB0002），上海市科技人才計劃項目（17XD1403300），上海精神障礙重點實驗室（13DZ2260500），上海市衛生和計劃生育委員會（精神病學）重點學科（2017ZZ02021）。

利益沖突

本研究不涉及任何利益沖突。

倫理審批

中國科學院動物保護與使用委員會批準本研究。所有實驗操作均嚴格遵循實驗動物管理委員會批準的《實驗動物研究方案》。

作者貢獻

武學慶設計實施本實驗，并完成初稿。

居云悅、焦東亮參與實驗設計和數據分析。

趙敏負責實驗設計和稿件修改。

所有作者閱讀并同意終稿的發表。