高寒濕地和草甸退化及恢復對土壤微生物碳代謝功能多樣性的影響

李 飛,劉振恒,賈甜華,李珊珊,白彥福,郭燦燦,王惟惟,孔 猛,張 濤,Awais Iqbal,周華坤,賈 宇,尚占環,,*

1 蘭州大學生命科學學院,草地農業生態系統國家重點實驗室,蘭州 730000 2 甘肅省瑪曲縣畜牧林業局草原站,瑪曲 747300 3 蘭州大學草地農業科技學院,蘭州 730070 4 青海省寒區恢復生態學重點實驗室,中國科學院西北高原生物研究所,西寧 810008

土壤微生物是土壤營養轉化、能量代謝的重要參與者,其群落多樣性變化受到土壤肥力[1]及植被特性(組成、生物量)[2]的影響。其中,土壤因素是土壤微生物群落變化的主要影響因素,其次是生物(地上生物量、植物物種豐富度)和環境(年降雨量)因素[3]。植物從土壤中攝取養分,同時又通過殘體及分泌物作用于土壤,而土壤微生物又是土壤養分循環的重要參與者,因此植被-土壤-土壤微生物三者間的相互作用,對于維持生態系統平衡十分重要[4]。土壤退化過程中,土壤肥力、植被性質的改變,必然影響土壤微生物群落多樣性的變化。因此,土壤微生物群落結構變化可作為土壤及植被變化的指示因子。

青藏高原高寒濕地,對全球生態系統平衡具有重要意義。近年來,由于全球變暖和人為干擾等因素的影響,濕地干化程度加劇,濕地向草甸演替。加之高強度的放牧進一步造成草甸退化、生產力降低,荒漠化、沙化程度加深,鼠害泛濫[5-6],而草甸退化導致土壤碳損失、營養降低、含水量降低,土壤肥力下降等一系列問題的出現,進一步加劇了土壤退化。土壤微生物對氣候及環境變化十分敏感,其群落結構變化也一定程度上反映了土壤營養狀況[7],因此土壤微生物群落結構差異可指示土壤環境的變化。

BIOLOG Eco作為一種研究微生物群落功能多樣性的方法,其通過土壤微生物對不同單一碳源的利用情況,直接獲得土壤微生物整體活性[8]及代謝功能的差異[9],是研究土壤微生物群落功能多樣性的主要方法[10]。目前針對草甸利用微生物碳代謝功能多樣性的研究主要集中在不同植被類型、恢復措施、干擾(放牧、鼠害、圍封、施肥)等方面,但目前尚未有綜合分析高寒濕地、草甸變化過程中土壤微生物碳代謝功能多樣性差異的研究。本文利用BIOLOG Eco研究退化及恢復干擾等因素作用下高寒濕地、草甸土壤微生物碳代謝功能多樣性的變化規律,探究高寒地區土壤微生物多樣性變化與土壤及植被性質的互作關系,為高寒地區生態系統退化和恢復及其評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

研究地點位于若爾蓋濕地瑪曲縣范圍,瑪曲縣位于甘肅省甘南藏族自治州(100°45′45″—102°29′00″E,33°06′30″—34°30′15″N),海拔3300—4806 m,屬高寒濕潤型氣候,年平均氣溫1.2℃,降水量615 mm,年蒸發量1352.4 mm[11]?，斍貐^牧草資源豐富,素有“亞洲第一優質牧場”之稱,同時也是黃河上游重要的水源涵養區,在畜牧業生產及生態系統服務功能方面具有重要價值。在全球變暖等自然及人為因素干擾下,瑪曲地區出現濕地萎縮、草場退化、水源涵養能力下降、土壤沙漠化等一系列環境問題[12]。針對這些問題,國家提出退牧還草、鼠害防治、防沙治沙等措施,但這些措施并未使退化趨勢得到有效遏制[13]。濕地不斷退化,減少面積大部分轉變為草甸,部分草甸也呈現退化趨勢,土地沙漠化面積得到有效控制[14-15]。

實驗按照瑪曲濕地、草甸變化序列,從濕地到沼澤化草甸、退化草甸,及人工恢復設置研究樣地。樣地有濕地(MQ- 1、MQ- 2)、沼澤化草甸(MQ- 3、MQ- 4)、高寒草甸(MQ- 5、MQ- 6、MQ- 7)、退化草甸(MQ- 10→MQ- 11→MQ- 12→MQ- 13→MQ- 14)、人工恢復草甸(MQ- 8、MQ- 9)。其中,MQ- 1、MQ- 2分別為兩種類型濕地,MQ- 3和MQ- 4均為沼澤化草甸,高寒草甸中包含兩種草甸(灌叢草甸MQ- 5和草甸(MQ- 6和MQ- 7))、退化草甸按退化強度進行分類,人工恢復草甸MQ- 8和MQ- 9分別為混播和單播人工草甸。各樣地基本情況見表1。土壤以泥炭土、草甸土為主。樣地植被以濕地、草甸植被為主,濕地主要優勢植被種分別為：堿毛茛(Halerpestesruthenica(Jacq.) Ovcz.)、兩棲蓼(PolygonumamphibiumL)、海韭菜(Triglochinmaritimum)、水麥冬(Triglochinpalustre)等。草甸主要優勢植被種分別為：青藏苔草(CarexmoorcroftiiFalc. ex Boott)、矮嵩草(Kobresiahumilis(C. A. Mey. ex Trautv.) Sergiev.)、雪蒿(ArtemisiaroxburghianaBess.)、黃帚橐吾(Ligulariavirgaurea(Maxim.) Mattf.)、金露梅(Potentillafruticosa)、披堿草(ElymusdahuricusTurcz.)、早熟禾(PoaannuaL.)、華扁穗草(BlysmussinocompressusTang et Wang)、長毛風毛菊(SaussureahieracioidesHook.f.)、異針茅(StipaalienaKeng)等。

1.2 土壤和植物樣品采集

于2015年8月,在甘肅省瑪曲縣境內,選取14種不同類型樣地,調查植物覆蓋度并采集植物和土壤樣本。植物樣品采用“0.5 m×0.5 m”樣方,齊地刈割后帶回實驗室,105℃殺青30 min,65℃烘干至恒重,測定地上生物量,粉碎后測定氮磷含量,3次重復(灌叢草甸采用“1 m×1 m”樣方[16])。根樣采集使用土鉆鉆取土芯,去除表面凋落物[17],3次重復,各重復間相距至少10 m,自封袋帶回實驗室清洗干凈,65℃烘干至恒重,粉碎后測定氮磷含量,3次重復。土壤樣品采用“三點混合法”取樣,3次重復,各重復間相距至少10 m,并剔除土壤樣品中石塊及植物殘體,裝入自封袋中,用冰袋將樣品運回實驗室,過2 mm篩(濕地樣品剔除植物殘體及碎石),部分4℃冰箱保存備用,其余風干測定土壤理化性質。

1.3 土壤和植物樣品理化性質測定

土壤基本理化性質見表2,pH采用pH計(Sartorius PB- 10,德國)測定,土壤有機碳采用重鉻酸鉀-內稀釋熱法測定,土壤、植物及根的全氮、全磷采用流動注射分析儀(FIAstar 5000 Analyzer,瑞典)測定,土壤含水量采用烘干法測定,土壤容重采用環刀法測定[18- 19]。

表1 各樣地基本概況

由于MQ- 1與MQ- 2為濕地,植物樣品采集困難,故沒有覆蓋度及生物量數據

表2 土壤基本理化性質

同列不同字母表示差異顯著(P<0.05); 由于MQ- 1為濕地,樣品采集困難,故沒有容重數據。TOC:總有機碳,total organic carbon; TN:全氮,total nitrogen; TP:全磷,total phosphorus

1.4 土壤微生物群落碳代謝功能多樣性測定

本實驗采用美國BIOLOG Eco Microplate測定土壤微生物群落碳代謝功能多樣性。BIOLOG Eco微平板為96孔板,板內包含3次重復,每個重復中含六大類(碳水化合物類(7種)、氨基酸類(6種)、羧酸類(10種)、胺類(2種)、磷酸化物質類(2種)、聚合物類(4種))[20]共31種不同單一碳源和一個空白對照,且其中多種碳源為根系分泌物。將土壤稀釋液接種于孔內進行培養,土壤微生物利用板內碳源使其發生顏色反應,利用酶標儀(Thermo Multiskan FC,芬蘭)讀數,獲得土壤微生物特征參數,從而很好的反映土壤微生物群落水平碳代謝功能多樣性。

稱取10 g混合均勻的新鮮土壤于250 mL錐形瓶中,在超凈工作臺中加入90 mL無菌生理鹽水(0.85% NaCl),封口膜封口,置于200 r/min的搖床上震蕩20 min,4 ℃靜置。取上清液,加入無菌生理鹽水稀釋103倍。將BIOLOG Eco板預熱至25 ℃,用8通道移液槍吸取150 μL稀釋液加入96板中,25℃恒溫培養箱培養7天[20],每隔24 h用酶標儀讀取595 nm吸光值數據[21-22]。

計算公式如下：

式中,AWCD(average well color development)為平均顏色變化率(微生物碳代謝活性)；Ci表示反應孔對應的吸光值；R表示對照孔的吸光值；n表示碳源數量。

式中,U為McIntosh均勻度指數；ni為第i孔的相對吸光值(ni=Ci-R)。

H′=-∑Pi·lnPi

式中,H′為Shannon豐富度指數；Pi為第i孔的相對吸光值ni除以總的相對吸光值。

1.5 數據統計分析

利用Excel對樣地基本數據進行計算和作圖,數據采用均值±標準誤進行統計。利用SPSS 21.0對數據進行單因素方差分析、Duncan多重比較。利用Pearson相關分析比較培養144 h時的AWCD值、均勻度指數U、豐富度指數H′和土壤及植被理化性質間的相關關系。利用Canoco for windows 4.5對土壤微生物碳代謝功能多樣性數據與理化性質進行除趨勢對應分析(DCA),確定排序方式為冗余分析(RDA),對結果進行Monte Carlo檢驗,并使用CanoDraw for windows進行繪圖。

2 結果

2.1 土壤微生物群落整體活性

平均顏色變化率(AWCD)表示土壤微生物群落的整體活性,也表示對碳源的整體利用情況。隨著培養時間的增加,AWCD值迅速升高,144 h后數值變化趨于平緩,生長趨勢呈“S型”增長,表明土壤微生物在不斷利用碳源。整體而言,不同類型樣地土壤微生物活性有差異。其中,沼澤草甸和草甸化沼澤AWCD值最大,沙化草地AWCD值最小。

利用微生物活性變化趨于平緩的144 h AWCD值對瑪曲地區不同類型樣地進行分析(圖1)。144 h AWCD值隨退化及干擾強度增加呈 “先上升后下降”的趨勢,表明隨退化程度的加深,土壤微生物總體活性先升高后逐漸降低。有水泥炭地和有水濕地均屬于濕地,但其微生物活性上也存在差異。沼澤草甸微生物活性最高。人工補播后的退化草甸AWCD升高,表明補播一定程度上提高了微生物總體活性。黃帚橐吾退化草甸由于毒雜草的侵入,AWCD值明顯下降,表明毒雜草侵入降低了微生物整體活性。黑土灘及沙化草地相比于草甸,AWCD值降低,表明草甸退化使得微生物活性顯著降低。

圖1 調查樣地144 h AWCD值比較Fig.1 Comparison of 144 h AWCD values of samples不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 土壤微生物多樣性指數

土壤微生物多樣性指數結果如圖2所示。McIntosh均勻度指數變化趨勢與AWCD(平均顏色變化率)相似,整體呈現 “先上升后下降”。沼澤草甸和草甸化沼澤McIntosh指數最高,沙化草地McIntosh指數最低。MQ- 9補播草甸相比于MQ- 10草甸,McIntosh指數有所增加,但不顯著。沙化草地McIntosh指數顯著低于對照草甸。MQ- 8補播草甸McIntosh指數顯著升高。Shannon豐富度指數表示群落差異度,反映群落豐富度。草甸化沼澤Shannon豐富度指數最高,沙化草地、有水泥炭地和有水濕地Shannon豐富度指數最低,其余樣地差異并不顯著。

圖2 不同類型樣地土壤微生物多樣性指數Fig.2 Soil microbial diversity indexes of different types of samples不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3 相關性分析

AWCD與土壤pH、有機碳、全氮、TOC/TN、TN/TP、含水量、容重、覆蓋度都有顯著相關性,McIntosh均勻度指數(U)與有機碳、全氮、TOC/TN、含水量、容重、覆蓋度均有顯著相關性,而Shannon豐富度指數(H′)與土壤理化性質無顯著相關性,卻與植物覆蓋度、氮磷含量有顯著相關性,AWCD、McIntosh均勻度指數(U)和Shannon豐富度指數(H′)之間存在極顯著正相關關系(表3)。由此可知,土壤微生物群落碳代謝活性(AWCD)較其均勻度和豐富度對植被與土壤性質響應更為敏感；均勻度較豐富度對土壤性質敏感,而后者較前者對植被地上部分氮磷含量更敏感,說明土壤微生物碳代謝功能多樣性可指示土壤及植被理化性質的變化,且微生物群落碳代謝豐富度主要依賴地上植被氮磷含量,而其代謝活性及均與度主要依賴土壤性質的變化。

2.4 土壤微生物碳代謝功能多樣性冗余分析

首先對土壤微生物碳代謝功能多樣性數據進行DCA分析,確定排序方式為RDA。不同樣地土壤微生物碳源利用率與環境變量的關系如圖3所示。圖中第一、二軸對變量的解釋率分別為54.2%、16.6%,共解釋變量的70.8%(Monte Carlo permutation 999,P=0.001)。第一軸解釋了大多數變量,其中各環境對土壤微生物碳代謝功能多樣性的影響(表4)如下：碳氮比>含水量>總有機碳>全氮>容重>覆蓋度>氮磷比>pH>植物含磷量>植物含氮量。其中,碳氮比、含水量、有機碳、全氮對土壤微生物碳代謝功能多樣性有極顯著影響(P<0.01),容重、覆蓋度、氮磷比、pH對土壤微生物碳代謝功能多樣性有顯著影響(P<0.05),植物氮磷含量對土壤微生物無顯著影響(P>0.05)(表4)。

表3 植物及土壤理化性質對土壤微生物碳代謝功能多樣性的貢獻率

*,P<0.05;**,P<0.01.TOC/TN:總有機碳與全氮的比值,the ratio of total organic carbon to total nitrogen; TOC:總有機碳,total organic carbon; TN:全氮,total nitrogen; TN/TP:全氮與全磷的比值,the ratio of total nitrogen to total phosphorus; TP(Grass):地上部分全磷含量,total phosphorus of aboveground; TN(Grass):地上部分全氮含量,total nitrogen of aboveground

表4 AWCD、U、H′與植物及土壤理化性質之間的相關性分析

*,P<0.05;**,P<0.01

圖3 不同類型樣地土壤微生物碳源利用率與環境變量的冗余分析Fig.3 Redundancy analysis of soil microbial carbon source utilization and environmental variables in different types of samples冗余分析表示土壤微生物碳代謝情況(符號)與環境變量(箭頭)間的關系;TP(Grass):地上部分全磷含量,total phosphorus of aboveground; TN(Grass):地上部分全氮含量,total nitrogen of aboveground; Coverage:植被覆蓋度,the coverage of plants; Moisture:土壤含水量,the moisture of soil; TN:土壤全氮含量,the total nitrogen of soil; TOC:土壤有機碳含量,the total organic carbon of soil; TOC/TN:總有機碳與全氮的比值,the ratio of total organic carbon to total nitrogen; TN/TP:全氮與全磷的比值,the ratio of total nitrogen to total phosphorus; pH:土壤pH值,pH value of soil; Bulk density:土壤容重,the bulk density of soil

3 討論

AWCD(平均顏色變化率)通過土壤稀釋液對碳源利用的吸光值變化來表示土壤微生物活性,其變化能很好地反映整體微生物功能多樣性[23]。濕地干化并逐漸向沙漠化轉變的退化過程中,土壤微生物活性先升高后降低。其中草甸化沼澤(MQ- 3)、沼澤草甸(MQ- 4)是濕地向草甸演替的中間過程,其微生物活性最高。相比于濕地,沼澤化草甸含水量、有機碳含量適當,利于微生物生長。有水泥炭地(MQ- 1)和有水濕地(MQ- 2)均為濕地,但MQ- 1土壤微生物活性顯著低于MQ- 2(P<0.05),主要是因為MQ- 1的土壤營養狀況及含水量均低于MQ- 2。灌叢草甸MQ- 5相比于沼澤化草甸,其土壤微生物活性顯著下降(P<0.05),而相比于草甸(MQ- 6、MQ- 7),其土壤微生物活性顯著增加(P<0.05)。主要是因為隨著退化程度的加劇,草甸荒漠化加深,土壤理化性質明顯改變,土壤肥力下降,植被類型減少,毒雜草逐步成為優勢種,微生物多樣性呈下降趨勢。人工補播草甸(MQ- 8、MQ- 9)通過影響植物覆蓋度,進而對微生物多樣性產生影響[24],且混播(MQ- 8)比單播(MQ- 9)顯著提高了土壤微生物活性(P<0.05)。

冗余分析結果表明,不同類型樣地對碳源的利用情況存在差異。碳源利用率結果顯示,聚合物類、氨基酸類、碳水化合物類是各樣地土壤微生物主要利用的碳源,其次為羧酸類、胺類,磷酸化物質類利用率最低。聚合物類中含有糖類及氨基酸的中間代謝物[21]；氨基酸類為土壤有機氮的主要來源,是植物根系分泌到土壤的有機化合物之一[25];碳水化合物類為土壤中最重要的有機成分之一[26]。

土壤微生物群落碳源利用差異主要受土壤營養狀況[27]、物理特性及植被[28]的影響。本研究結果表明,土壤有機碳、全氮、含水量、C/N、N/P、植物覆蓋度與微生物功能多樣性呈顯著正相關(P<0.05),而土壤pH與土壤微生物功能多樣性呈顯著負相關(P<0.05)。前人研究也發現,土壤微生物多樣性主要受pH[29]、有機碳[30- 31]、全氮[30,32]、碳氮比[33]、氮磷比[31]、含水量[30]、容重[34]、植物覆蓋度[31]等因素的影響。土壤容重通過影響土壤孔隙度、通氣狀況直接對土壤微生物(特別是好氧微生物)產生影響[34]。地上植被覆蓋度影響土壤含水量[35],土壤含水量、氮磷比又通過限制植物生長,影響植物覆蓋度、生物量及豐富度[31,36],進而間接影響土壤微生物活性。土壤含水量又是影響土壤碳氮循環過程中相關微生物的關鍵因素,其通過影響土壤有機碳、全氮,進而對土壤微生物活動尤其是碳氮循環產生影響[37]。

濕地由于氣候變暖及人為干擾等因素的影響,逐漸演替為沼澤化草甸,而人為排干進一步促使向高寒草甸演替,加之放牧等因素的影響,高寒草甸不斷退化并不斷向荒漠化演替。隨濕地退化程度的加劇,土壤營養狀況下降,影響植物生長,進而對土壤微生物產生影響,而土壤微生物又是參與礦化、有機質分解、養分循環的重要因子,因而導致三者處于惡性循環,退化程度加劇。補播使得土壤微生物群落功能多樣性有所增加,主要是人工補播使得土壤理化性質及植被性質改變[38],土壤營養狀況有所改善,因而人工補播對于高寒退化草地恢復十分重要[39]。因而,維持“植物-土壤-微生物”三者間的平衡,對于濕地恢復十分重要。

4 結論

不同類型樣地土壤微生物在對單一碳源利用上存在顯著差異。其中,草甸化沼澤對碳源的利用率最高,其次是濕地；隨退化程度加劇,草甸對碳源利用率降低,沙化草地利用率最低；人工補播草甸能一定程度的改善土壤微生物活性,提高碳源利用率；濕地、草甸退化及恢復對土壤微生物碳代謝功能多樣性造成了顯著的影響(P<0.05)。土壤微生物對6大類碳源代謝能力表現為：聚合物類利用效率最高,其次為氨基酸類、碳水化合物類、羧酸類、胺類,聚合物類利用效率最低。RDA分析發現,土壤微生物群落結構有明顯的差異。土壤微生物群落結構的差異主要受土壤、植被理化性質的影響,其中碳氮比、含水量、有機碳、全氮對土壤微生物多樣性有極顯著影響,而容重、氮磷比、pH、植物覆蓋度對其有顯著影響。