甘肅小隴山油松與柴胡栽培土壤細菌群落特征

萬 盼,胡艷波,張弓喬,王宏翔,李錄林,王 鵬,惠剛盈,*

1 中國林業科學研究院林業研究所,國家林業局林木培育重點實驗室, 北京 100091 2 甘肅省小隴山林業實驗局林業科學研究所, 天水 741020

土壤微生物是土壤與植物的紐帶,在土壤生態系統養分循環和能量流動過程中起重要作用。土壤中細菌群落在微生物中所占比例很高,是土壤物質循環的最主要參與者,其群落結構和多樣性能夠反映土壤環境質量的變化過程[1]。已有研究表明,土地利用方式的改變以及不同的管理措施,可以導致土壤微生物群落的改變,進而影響土壤性質和微環境[2- 3]。比如,Dong 等[4]表明,與傳統耕作方式相比,連作可以改變土壤微生物群落結構；Zhang等[5]發現不同植物下的土壤微生物群落多樣性均高于沙地土壤,說明土地利用方式可以改變土壤微生物群落結構；Annamaria等[6]研究表明,經營方式的不同也可以改變土壤細菌群落組成及其豐富度。

小隴山自然保護區是我國暖溫帶-亞熱帶過渡地帶,由于自然因素和人為因素的影響,導致該地區生態系統的退化。近年來,退耕還林政策的實施,大面積人工林在當地推廣,以期改善區域生態環境脆弱的現狀。我國特有樹種油松(PinustabulaeformisCarr.)是該區域退耕還林的主要樹種,近年來在小隴山發展迅速[7- 8]。柴胡(Bupleurumchinense)屬藥用植物,在小隴山自然保護區,耕地被農民用來長期耕種柴胡,作為一種經濟作物；而現在大面積的柴胡地普遍被改為培育油松苗。耕地變林地,土地利用方式的改變,相應的土壤微生物群落結構和多樣性也將發生變化[9]。Fierer[10]對北美到南美土壤微生物群落空間變異進行研究,表明土壤細菌群落的多樣性和物種豐富度隨地上生態系統類型的變化而變化；Huang等[11]研究表明,黃土高原農耕地植被的恢復能夠使得微生物群落結構改變,改善了土壤生態。當地有關油松苗的研究僅集中在育苗栽培與造林技術[12]、林分生長模型[13]和更新[14]等方面,因此,我們應及時深入探究耕地上栽植油松苗后土壤微生物群落的變化情況,進而了解土壤質量的變化情況,這對當地實現合理的植被管理和土地可持續利用具有重要意義。

新一代測序技術-高通量測序具有產生數據量大、測序周期短、準確率高以及成本低等優點,在微生物生態學的研究中凸顯出明顯的優越性[15- 18]。對此,本研究以小隴山典型的油松人工苗和柴胡作為對象,采用高通量測序方法,對常見的2種人工植被類型下土壤細菌群落結構和多樣性進行了分析,以期為當地進行人工油松苗的種植、經營及土壤管理提供科學依據。

1 研究區域概況

小隴山林區位于甘肅省東南部,地處秦嶺西段,屬暖溫帶向北亞熱帶過渡地帶,兼有我國南北氣候特點,大多數地域屬暖溫濕潤-中溫半濕潤大陸性季風氣候[19]。年平均氣溫,極端最高氣溫39.2℃,極端最低氣溫-23.2℃,年降水600—900 mm,主要集中于7、8、9月,年蒸發989—1658 mm,相對濕度68%—78%,年日照時1520—2313 h,無霜期130—220 d,區內秦嶺以北的地帶性土壤為灰褐土,以南為黃褐土,土壤垂直分布較明顯[20]。

2 研究方法

2.1 樣地設置與樣品采集

土壤采集于2017年5月進行；選擇具有代表性的油松人工苗地和柴胡種植地各3塊面積為20 m×20 m的樣地,且各樣地之間環境條件相似、相距較近；樣地海拔基本相等(約為1365—1379 m),每個植被類型3個樣地分布在不同坡位,分別在上、中和下,坡度大約為12°—4°,坡向為西南。柴胡作為一種藥用植物,在當地被作為經濟作物長期種植；油松是移栽至種植柴胡的耕地上,生長期為4 a,其地徑、苗高和冠幅分別約為4.12、152.50、109.10 cm。柴胡和油松苗的管理方式相似：柴胡于每年6月人工施肥一次,7—8月人工除草一次；油松苗移栽至耕地,于每年開春、土壤解凍后施肥一次,分別在6、8月和10月進行3次人工除草。

在每個樣地采用五點法取樣,先除去表層凋落物,采集表層(0—30 cm)土壤,多點均勻混合,混合土樣時剔除雜質,取一部分土壤樣品放入消毒無菌的自封袋,放在4℃冷藏箱保存并盡快帶回實驗室,放在-80℃冰箱中保存,用于土壤微生物多樣性分析；另外,再取一部分土壤樣品裝入自封袋,帶回實驗室自然風干后過篩用于土壤理化性質分析。

2.2 土壤理化性質測定

有機質含量采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法；全氮含量采用凱氏定氮法測定；全磷含量采用酸熔-鉬銻抗比色法測定；全鉀采用NaOH熔融、火焰光度法測定；堿解氮含量采用堿解擴散法測定；有效磷含量采用鹽酸-氟化銨提取-鉬銻抗比色法測定；速效鉀含量采用乙酸銨浸提-火焰光度法測定。以上測定方法參見《土壤農業化學分析方法》[21]。

2.3 土壤DNA 抽提和PCR擴增

根據MP-FastDNATMSpin kit for soil試劑盒 (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)說明書進行總DNA抽提,DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量；用515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGG- 3′)和907R (5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT- 3′) 引物對V3-V5可變區進行PCR擴增,擴增程序為：95℃ 預變性3 min,27個循環(95℃ 變性30 s,55℃ 退火30 s, 72℃ 延伸45 s),最后72℃延伸 10 min (PCR儀：ABI GeneAmp? 9700型)。擴增體系為20 μL,4 μL 5*FastPfu 緩沖液,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs,0.8 μL 引物(5μmol/L), 0.4 μL FastPfu 聚合酶；10 ng DNA模板。

2.4 Illumina Miseq 測序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) 進行純化,Tris-HCl洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST (Promega, USA) 進行檢測定量。根據Illumina MiSeq 平臺 (Illumina, San Diego,USA)標準操作規程將純化后的擴增片段構建PE250的文庫。

構建文庫步驟: (1)連接“Y”字形接頭; (2)使用磁珠篩選去除接頭自連片段; (3)利用PCR擴增進行文庫模板的富集; (4)氫氧化鈉變性, 產生單鏈DNA片段。利用Illumina公司的Miseq PE250平臺進行測序(上海美吉生物醫藥科技有限公司)。

2.5 數據處理

原始測序序列使用Trimmomatic 軟件質控,使用FLASH軟件進行拼接：

(1)設置50 bp的窗口,如果窗口內的平均質量值低于20,從窗口開始截去后端堿基,去除質控后長度低于50 bp的序列；

(2)barcode需精確匹配,引物允許2個堿基的錯配,去除模糊堿基；

(3)根據重疊堿基overlap將兩端序列進行拼接,overlap需大于10 bp。去除無法拼接的序列。

使用UCHIME軟件剔除嵌合體,得到優化序列；根據97%的相似度對序列進行OTU聚類。利用mothur軟件對所有序列進行隨機抽樣,以抽取到的序列數與它們所能代表OTU的數目構建稀疏曲線(Rarefaction curve)；基于OTU進行稀釋性曲線分析,并計算Chao1豐度指數,覆蓋度(Coverage)和Shannon多樣性指數,Shannoneven均勻度指數；比對Silva數據庫(SSU123)(設置比對閾值為70%),利用RDP-classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) 對每條序列進行物種分類注釋,并在各個分類水平上統計每個樣品的群落組成；利用冗余分析研究土壤化學指標與細菌群落關系。

3 結果與分析

3.1 土壤化學性質

可知,油松苗地的土壤有機質、全磷、有效磷含量和pH值均低于柴胡地；其中,兩者之間的有機質和全磷含量差異均達到顯著水平(P<0.05)；然而, 油松地土壤的全氮、堿解氮、全鉀和有效鉀含量均大于柴胡地土壤,但之間差異均未達到顯著水平(P>0.05)(表1)。

表1 2種植被下土壤化學性質

不同小寫字母表示在0.05水平下具有差異

3.2 細菌高通量測序數據特性

圖1 不同土壤樣品細菌稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of soil bacteria in different sampled

稀釋曲線(Rarefaction curve)是用來描述隨著樣品量的加大,可能檢測到的物種種類隨之增加的狀況,是調查樣品的物種組成和預測樣品中物種豐度的有效工具,在生物多樣性調查中,被廣泛用于判斷樣品量是否充分以及估計物種豐度?？梢钥闯?土壤的6個樣品對應的稀釋曲線均基本趨于平緩,說明取樣比較合理,實際環境中細菌群落結構的置信度較高,能夠比較真實的反映出樣品的細菌群落(圖1)。

3.3 土壤細菌群落Alpha多樣性

各處理組的細菌的Coverage指數都大于90%,說明在OTU水平上的測序結構能夠反映所測樣本中細菌的真實情況。OTUs表示豐土壤微生物豐富度實際觀測值,可以看出,油松土壤細菌的OTUs小于B,但差異均不顯著(P>0.05)。油松土壤細菌的Chao1指數小于柴胡,但差異也均不顯著(P>0.05)；油松土壤細菌的Shannon指數小于柴胡,但差異也不明顯(P>0.05)。油松土壤細菌的Shannoneven指數小于柴胡,差異均達到顯著水平(P<0.001)(表2)。

表2 2種植被下土壤細菌多樣性指數

3.4 群落組成分析

兩種植被下土壤共檢測出37個細菌門和84個細菌綱；其中,34個門為共有細菌門,占91.9%；79個綱為共有細菌綱,占94.0%(圖2)。對每個有效序列進行門(Phylum)水平上的注釋分類,兩種植被的土壤檢測出10個以上細菌門(相對豐度大于1%)主要有：變形菌門(Proteobacteria),酸桿菌門(Acidobacteria),綠彎菌門(Chloroflexi),浮霉菌門(Planctomycetes),放線菌門(Actinobacteria),芽單胞菌門(Gemmatimonadetes),擬桿菌門(Bacteroidetes),硝化螺旋菌門(Nitrospirae)(圖3)。這些鑒定出來的細菌門,按照豐富度由高到低排列均為(優勢菌在兩個植被土壤中豐富度高低順序一致)：變形菌門(Proteobacteria)>酸桿菌門(Acidobacteria)>綠彎菌門(Chloroflexi)>浮霉菌門(Planctomycetes)>放線菌門(Actinobacteria)>芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)>擬桿菌門(Bacteroidetes)>硝化螺旋菌門(Nitrospirae)。通過物種差異分析得出,油松地土壤中的變形菌門(Proteobacteria)豐度顯著低于柴胡土壤(P<0.05),綠彎菌門(Chloroflexi)的豐度卻顯著高于柴胡土壤(P<0.05)；而其他細菌門在兩者之間差異不明顯,未達到顯著水平(P>0.05)(圖3)。

圖2 門和綱水平下的細菌物種Venn圖Fig.2 The Venn map of bacterial community at phylum level (Ⅰ) and class leve (Ⅱ)圖注：(門水平下)Proteobacteria 變形菌門,Acidobacteria 酸桿菌門,Chloroflexi綠彎菌門,Planctomycetes浮霉菌門,Actinobacteria 放線菌門,Gemmatimonadetes 芽單胞菌門,Bacteroidetes擬桿菌門,Nitrospirae 硝化螺旋菌門；(綱水平下)Acidobacteria酸桿菌綱,Betaproteobacteria β-變形菌綱,Actinobacteria放線菌綱,Alphaprotebacteria α-變形菌綱,Gemmatimonadetes芽單胞菌綱,Dellaproteobacteria Δ-變形菌綱,Planctomycetocia浮霉菌綱, Anaerolinease厭氧繩菌綱

圖3 門和綱水平下的細菌群落組成Fig.3 Composition of bacterial community at phylum level and class leve

在綱分類水平上,兩個植被的土壤優勢菌為：酸桿菌綱(Acidobacteria),β-變形菌綱(β-proteobateria),放線菌綱(Actinobacteria),α-變形菌綱(α-proteobacteria), 芽單胞菌綱(Gemmatimonadetes),Δ-變形菌綱(Δ- proteobateria),浮霉菌綱(Planctomycetocia), 厭氧繩菌綱(Anaerolineae)。綱水平上的優勢菌豐富度高低順序在兩個植被土壤不太一致,但均是酸桿菌綱(Acidobacteria)豐富度最高,而β-變形菌綱(β-proteobateria)豐富度次之。同樣,通過物種差異分析得出,各優勢菌的豐度在兩個植被土壤之間差異不顯著(P>0.05)(圖3)。

3.5 環境因子對細菌群落的影響

相關性分析表明,變形菌門(Proteobacteria)相對豐富度與堿解氮呈顯著負相關(P<0.05),酸桿菌門(Acidobacteria)相對豐富度與全氮呈顯著負相關(P<0.05),放線菌門(Actinobacteria)相對豐富度與全氮和堿解氮均呈顯著負相關(P<0.05),芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)相對豐富度與堿解氮呈顯著負相關(P<0.05),擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐富度與有效磷呈顯著正相關(P<0.05)(表3)。

表3 土壤細菌優勢菌(門水平下)相對豐富度與土壤化學性質的相關性

**P<0.01 ,*P<0.05

可知,有機質,全氮,全鉀,堿解氮和全磷含量均對土壤細菌具有顯著影響；其中,堿解氮和全氮因子對細菌的影響最大。RAD分析顯示,第一排序軸解釋了樣本中94.72%的變異,第二排序軸解釋了樣本中3.00%的變異,兩者結合解釋率達97.72%(圖4)。

圖4 土壤細菌與土壤化學因子的冗余分析 Fig.4 Representative difference analysis (RDA) of the relationships between soil physiochemical properties and bacterial communites under two vegetations

4 討論

通過高通量測序技術分析2種人工植被類型下土壤細菌群落結構及其多樣性。由稀釋曲線可知,本研究采集的土壤樣品合理,其鑒定結果能夠準確的反映實際土壤樣品中細菌群落；同樣,對土壤樣品中細菌測序得到的文庫覆蓋率(Coverage)均達到95%以上,表明樣品適合分析細菌多樣性。雖然本次調查采集的植被土壤面積有限,但樣品采集仍具有一定代表性,能夠反映該研究區域2種植被類型的土壤細菌群落結構。

4.1 2種植被類型下土壤微生物群落組成

通過新一代高通量測序技術分析土壤微生物群落結構,具有快速獲取大量信息的優勢,并且將這些信息按照需要進行相關解析。本研究在2個植被土壤樣品中,細菌鑒定出變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)等37個門,其中,變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)均是2種植被土壤中豐富度極高的細菌群類,變形菌門為豐富度最高優勢菌門,而該區域土壤呈堿性,這也就證實了變形菌門(Proteobacteria)為堿性土壤中的主要優勢群落,這與很多[22- 24]研究結果相似；也有一些研究得出的結論與之不同[25],可能是由于土壤間的異質性造成的。同樣,兩種植被的土壤共檢測到84個細菌綱；其中,豐富度較高的優勢菌主要為酸桿菌綱(Acidobacteria)和β-變形菌綱(β-proteobateria),這與劉洋等[26]研究結果相似,即這兩種優勢菌均普遍存在土壤中且豐富度最高。這些研究結果也說明了,盡管植被類型不同,但處于相同生境中的土壤微生物類群具有相似性。

變形菌門(Proteobacteria)是一大類細菌門類,在很多土壤細菌群落研究中具有很高的相對豐度[27- 28],其包含有能與植物共生的固氮細菌,可以增強土壤的固氮能力,屬于異養型細菌。有研究表明,土壤變形菌門豐富度的高低可以在一定程度上反映土壤有機質等養分含量的高低。綠彎菌門(Chloroflexi)是一類通過光合作用,以CO2為碳源產生能量的細菌,因此在有機質含量低的土壤中具有競爭力[29]。對比油松地和柴胡地土壤微生物群落發現,油松地土壤中變形菌門(Proteobacteria)的豐度顯著低于柴胡地土壤,綠彎菌門(Chloroflexi)的豐度顯著高于柴胡地土壤,但酸桿菌門(Acidobacteria)的豐度在兩者間卻無明顯差異。植物生長過程中產生的有機物質(包括植物根系分泌物)進入土壤,直接影響土壤微生物的群落組成；由于不同植被生理特性存在差異,產生的有機物質種類和數量不同,導致不同植被下土壤微生物物種出現差異[30]。與柴胡相比,油松苗雖然會產生較多的枯落物輸入土壤,但其屬于深根樹種,根系發達且穿透能力強,對土壤理化性質影響比較大,能汲取大量的養分物質,導致土壤有機質含量較柴胡地低；變形菌門(Proteobacteria)在有機質含量較高的柴胡地更適合生存,但綠彎菌門(Chloroflexi)更適合在有機質含量較低的油松林地生存。這可能是優勢細菌門中的變形菌門和綠彎菌門在兩者之間的存在顯著差異的原因。

酸桿菌綱(Acidobacteria)屬于酸桿菌門類,是一種研究相對較少的細菌門類,但普遍以較高豐富度存在土壤中[24]；有研究表明[31],酸桿菌門(Acidobacteria)多出現在陸地且酸性較強的環境中,而柴胡和油松的土壤均發現該細菌的存在,說明土壤環境有可能存在酸化的傾向。變形菌門主要包括α-變形菌綱和β-變形菌綱,其包含很多能夠與植物共生的固氮細菌,可為土壤提供更強的固氮能力。β-變形菌綱能夠利用土壤中有機物質分解產生的氨氣和甲烷[24]；一般變形菌門中,α-變形菌綱豐富度高于β-變形菌綱[26]；也有一些研究表明,β-變形菌綱(β-proteobacteria)的豐富度卻大于α-變形菌綱(α-proteobacteria)[32-33],這與本研究結果一致。然而,在綱分類水平下的優勢菌的豐度在兩種植被土壤中均無明顯差異。

4.2 2種植被類型下土壤微生物多樣性

采集的土壤中共檢測到的細菌有37個門,84個綱,168個目,296個科和485個屬,將序列相似性>97%的序列歸為同一OTUS,兩種植被的OTUS分別為2218(油松)和2354(柴胡)。微生物群落多樣性是描述土壤生態特征的關鍵指標,可以通過一系列多樣性指數來反映,最常用的指標有Chao1指數、Shannon指數和Shannoneven指數。Chao1指數是用來估計土壤樣本中物種總數,值越大表示樣品中微生物豐富度越高；Shannon指數反映土壤微生物多樣性,值越高,群落多樣性越高；Shannoneven指數表示土壤微生物物種分配的均勻度程度,值越大則說明物種分配均勻程度越高。微生物群落結構和組成多樣性增大有助于增加土壤生態環境的穩定性[34]。細菌廣泛存在土壤中,也是土壤中個體數量最多的有機體,存在土壤中或者與植物根系共生,能夠參與土壤生態系統的物質轉化和循環,利于植物生長發育。本研究發現,2兩種植被類型的土壤細菌的Chao1指數和Shannon指數差異均不顯著,只是細菌的Shannoneven指數表現為油松地土壤小于柴胡地土壤。這說明,土壤細菌群落的豐富度和多樣性在2種植被下無明顯差異,但油松地土壤細菌群落的物種分配較柴胡地集中。不同植被對土壤營養物質的代謝及呼吸等生命活動會影響環境因子,進而造成微生物群落多樣性發生變化[35]。油松較柴胡根系龐大且較深,對土壤的物理性質(結構、孔隙度等)或者養分影響較大,進而使得細菌群落物種分配不均勻。

土壤微生物多樣性可以反映土壤肥力高低。有研究表明,細菌多樣性高,土壤表現出較高的肥力,而真菌多樣性高,則表現出較低的土壤肥力[36]。從土壤細菌多樣性的研究結果來看,兩種植被下土壤細菌多樣性無明顯區別,根據前人研究結果,可以初步認定兩種植被土壤肥力無差異；然而,本研究同時表明,油松苗地土壤有機質含量和全磷含量卻明顯低于柴胡地土壤,這可能跟兩種土壤真菌群落多樣性差異有關,這需進一步分析兩種植被土壤真菌群落多樣性來證實。

4.3 土壤養分對細菌群落結構的影響

研究表明,土壤養分含量能夠影響土壤微生物種群數量及分布,而不同植被的營養物質代謝等生命活動不同,導致土壤養分具有差異[37]。在細菌群落的優勢門中,變形菌門(Proteobacteria)與堿解氮顯著負相關,酸桿菌門(Acidobacteria)與全氮顯著負相關；通過RAD綜合分析得出,有機質、全氮、全鉀、堿解氮和全磷均對土壤細菌群落結構具有顯著影響,其中,群落受堿解氮和全氮影響較大,且環境因子對細菌的解釋率為97.72%。本研究也表明,油松地土壤的有機質含量和有效磷含量均顯著低于柴胡地,其他養分含量無顯著差異,這就說明了2種植被下土壤由于堿解氮和全氮含量無明顯差異,因而未導致細菌群落多樣性出現差異。然而,長期種植油松苗將會導致土壤養分處在較低水平,因此在大苗培育期要因土施肥,提高土壤肥力,尤其需要及時補充土壤有機質,這樣既可以增加土壤養分又可提高細菌豐度和多樣性。

5 結論

綜上可知,通過高通量測序技術分析2種不同土地利用方式下山麓耕地土壤細菌群落結構及其多樣性,得出以下結論：(1)油松地和柴胡地的土壤細菌豐度和多樣性無明顯差異,但油松地土壤細菌群落的物種分配較柴胡地集中。(2)兩種植被土壤的優勢細菌門均為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)；主要的優勢菌綱為酸桿菌綱(Acidobacteria),β-變形菌綱(β-proteobacteria),放線菌綱(Actinobacteria)；且僅有優勢細菌門中的變形菌門和綠彎菌門在兩者之間的差異顯著,即油松地土壤中的變形菌門(Proteobacteria)的豐富度顯著低于柴胡地土壤,綠彎菌門(Chloroflexi)豐富度卻顯著高于柴胡地。(3)變形菌門(Proteobacteria)與土壤的堿解氮含量呈顯著負相關,酸桿菌門(Acidobacteria)與全氮顯著負相關；總體來看,堿解氮和全氮對土壤細菌群落影響較大,被環境因子解釋率均達到97%以上,是影響細菌群落的最主要的土壤因子。長期種植油松苗將會導致土壤養分處在較低水平,因此,在大苗培育期中要因土施肥,提高土壤肥力,尤其需要及時補充土壤有機質,這樣既可以增加土壤養分又可提高細菌豐度和多樣性。本研究結果可為認識小隴山不同植被土壤微生物群落組成及多樣性提供理論,同時,也為當地進行人工油松苗的種植、經營及土壤管理提供科學參考。