長鏈非編碼RNA及其與人類疾病之間關系的研究概述

汪顯坤 林欣婭 胡雪峰

(福建師范大學生命科學學院 福州 350108)

1 長鏈非編碼RNA簡介

2002年，日本科學家Okazaki在對小鼠cDNA文庫大規模測序時第一次發現了一類較長的轉錄產物，并將其命名為長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA， lncRNA)[1]。lncRNA是一類長度為200～10 000 nt之間的非編碼RNA。研究表明，人類許多疾病的發生都涉及到lncRNA的過度表達、缺失或突變；另一方面，lncRNA能在X染色體失活、染色質修飾、干細胞定向分化以及轉錄沉默、激活等重要生物學過程中施加影響。

1.1 lncRNA的種類 根據與編碼蛋白基因的位置關系，lncRNA分為以下幾種： ①反義lncRNA(antisense lncRNA),由編碼蛋白基因的反義鏈(模板鏈)轉錄而成；②正義lncRNA(sense lncRNA),由編碼蛋白基因的正義鏈(非編碼鏈)轉錄而成；③內含子lncRNA(intronic lncRNA),完全由基因的內含子區域編碼而成；④基因區間lncRNA(large intergenic noncoding RNA, lincRNA),由兩個基因之間的區域編碼而成，因此不與編碼基因的內含子和外顯子相重疊；⑤反義上游lncRNA(antisense ustream lncRNA),其序列位于反義鏈上游,編碼基因的啟動子為雙向啟動子，采用與編碼基因轉錄的反方向進行轉錄，因而與編碼基因頭對頭相鄰；⑥增強lncRNA(enhancer lncRNA)，由基因的增強子轉錄而成的，可以促進基因轉錄[2]。

1.2 lncRNA的產生方式 lncRNA有以下產生方式： ①編碼基因的發生框插入一段序列，進而破壞原有的編碼功能，轉錄成一個與先前編碼序列合并的lncRNA；②染色質在發生重排后，兩個不轉錄并且間隔距離很遠的序列區合并到了一起，產生了一個含多個外顯子的lncRNA；③在兩次連續的重復時間內，ncRNA內部產生相鄰的重復序列以增加ncRNA的核酸數，從而產生lncRNA；④通過轉座因子的自由插入產生一個有功能的lncRNA；⑤非編碼基因通過反轉錄轉座作用復制，產生一個有功能的非編碼逆轉錄基因，或產生一個無功能的逆轉錄基因。

1.3 lncRNA的結構和功能特點 在人類基因組中約有70%的基因被轉錄成RNA，但只有2%左右的RNA編碼蛋白質的合成。與mRNA相同，lncRNA也是由對應的基因轉錄而成，具有5′帽子、poly(A)尾巴和啟動子結構，通過前體的適當剪接，便可形成成熟體的lncRNA；同一基因可以形成不同的轉錄本的lncRNA。然而，與miRNA相比lncRNA具有相對較長的核苷酸鏈，在發揮作用時既可以與DNA雜交來調控基因的表達，也可與mRNA結合來調控轉錄；更重要的是，它能夠通過空間的盤曲，折疊成許多特定而復雜的二級結構，這些獨特的空間結構能夠提供分子結合位點，從而使其可以行使特定的生物學功能。

2 lncRNA與人類疾病

2.1 lncRNA與癌癥 主要介紹lncRNA與肝癌、肺癌、胃癌和乳腺癌之間的關系。

2.1.1 肝癌 肝癌是常見的癌癥，具有轉移發生率高以及術后復發率高的特點。lncRNA具有與微小RNA(micro RNA, miRNA)競爭性結合、從而使mRNA正常表達的功能。miRNA是一類序列小于200 nt的非編碼RNA，可以與靶mRNA通過堿基互補配對結合，從而抑制mRNA的表達[3]。在肝癌的研究中發現，名為miR-372的mRNA與cAMP依賴蛋白激酶(PRKACB)的mRNA 3’非編碼區有相同靶點，從而抑制PRKACB基因的表達。肝癌高表達轉錄本(HULC)在肺癌組織中高水平表達，而lncRNA-HULC作為一種內源性的“海綿”可以競爭性地抑制miR-372的活性，進而上調靶基因PRKACB的表達，誘導磷腺苷效應原件結合蛋白(CREB)的磷酸化。磷酸化的CREB會結合到HULC基因的近端啟動子區域，促進RNA聚合酶Ⅱ與染色質的結合，進而激活致癌基因HCLU的轉錄[4]。這是一種正反饋的調節機制。根據以上的調節機制，lncRNA-HULC可以作為早期肝癌預測與診斷的標志物。

在研究間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSC)對肝癌發生的作用時，發現一些lncRNA異常表達，并鑒定出一種在肝癌組織中高表達、名為lncRNA-MUF的、新的lncRNA。研究表明lncRNA-MUF可以結合膜聯蛋白A2(annexin A2, ANXA2)，進而激活Wnt/β-連環蛋白信號通路(Wnt/β-catenin)和上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，而EMT可以減少腫瘤細胞的凋亡與衰老，增強耐藥性[5]。同樣lncRNA-MUF也可以作為miR-34a的競爭性內源RNA，導致轉錄因子Snail1上調和EMT活化。

2.1.2 肺癌 肺癌主要分為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)，其中，NSCLC的發病率占總數的85%。在NSCLC中，lncRNA-MEG3(maternally expressed gene 3)通過多條信號通路發揮作用： 在p53通路中，p53抑癌基因是MEG3的下游靶點，MEG3與癌基因(murine double minute2, MDM2)作用，阻礙MDM2對p53蛋白的泛素化降解，從而活化p53，抑制癌細胞生長；在Rb通路中，Rb的活化可以下調DNA甲基轉移酶1(DNA methyltransferase 1, Dnmt1)的表達，降低MEG3基因及其附近DNA的甲基化水平使MEG3高表達，從而抑制癌細胞的增殖[6]、調節血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和跨膜受體蛋白(Notch)的信號通路。

lncRNA會影響前體mRNA(pre-mRNA)的可變剪接。研究表明，肺腺癌轉移相關轉錄本1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1)是一條長度為8 708 nt的lncRNA，它與癌癥的發生和發展有著密切的關系。研究發現，MALAT1能夠招募絲氨酸/精氨酸結合SR(serine/argine)蛋白剪接因子，通過控制SR蛋白的富集方式，調節其在細胞核內的分布和活性，從而影響一些pre-mRNA的可變剪接。近年來，不斷有新的lncRNA被發現并被證實與肺癌的發生與遷移有著重要的關系。例如，李雪萍等[7]發現lncRNA-LOC90024與肺癌的發生密切相關，當過表達LOC90024時，可顯著促進肺癌細胞生長和遷移。因此，lncRNA-LOC90024可能作為癌基因發揮作用，有望提供新的治療靶點。

2.1.3 胃癌 我國胃癌的發病率和死亡率高居世界第二。lncRNA-H19可促進細胞增殖。例如，在人胃腺癌AGS細胞系中上調H19基因后，癌細胞增殖明顯增加，而沉默H19基因后，癌細胞呈現持續凋亡的狀態。其調節機制涉及H19/ISM1和miR-675/CALNI兩條通路，當過表達H19基因時，一方面使ISM1上調，呈正相關，另一方面通過miR-675抑制CALN1的表達，促進癌細胞的增殖與轉移[8]。除了通過多條信號通路來調節之外，也可通過lncRNA與靶mRNA結合來調節。胃癌高表達轉錄本1(gastric carcinoma proliferation enhancing transcript 1, GHET1)是與胃癌發生、發展、遷移密切相關的lncRNA。GHET1與胰島素樣生長因子mRNA結合蛋白1(insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 1, IGF2BP1)結合，IGF2BP1再作用于癌基因c-Myc mRNA，使c-Myc mRNA維持穩定并提高表達水平[9]。而c-Myc的表達產物使細胞無限增殖，并且可調節細胞的惡性轉化，是早期發現的一種重要的癌基因。

2.1.4 乳腺癌 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發病率和死亡率都高居女性癌癥的首位，嚴重影響女性的健康生活。lncRNA調控著乳腺癌的發生和轉移。人們對生長阻滯特異轉錄本5(GAS5)研究最為深入，在乳腺癌中，GAS5基因是Notch-1信號傳導通路中的下游靶點。研究表明，當干擾Notch-1時，乳腺癌細胞中的GAS5基因的轉錄水平可顯著提高，從而誘導癌細胞的凋亡和生長阻滯[10]，GAS5和miR-21還存在著相互抑制、雙向調控的機制，以促進癌細胞的生長[11]。GAS5可靶向糖皮質激素受體(GR)的DNA結合區，阻礙受體和下游蛋白的表達，影響細胞的增殖和代謝?；谝陨蠙C制，GAS5可作為手術預后評估的重要標志物。除此之外，lncRNA ANRIL的基因在肺癌、肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤的組織中也高水平表達，充當原癌基因的作用。在乳腺癌細胞系MCF7細胞的研究中發現，ANRIL可能通過與PRC2的核心亞基——多梳蛋白SUZ12相互作用，介導組蛋白的甲基化，沉默p15基因的轉錄，當ANRIL基因沉默時，干擾SUZ12與p15的結合，從而促進p15的表達，并進一步促進乳腺癌細胞的增殖和侵襲[12]。ANRIL還可通過相同的機制來沉默p53基因。

2.2 lncRNA與心血管疾病 心血管疾病常常伴有心肌增厚、心力衰竭、心肌梗死等癥狀，而lncRNA與心肌細胞的分化密切關系，因此也在疾病的發生中發揮著重要的作用。研究發現，在血管緊張素(AngII)誘導的人心肌增厚的模型中，心肌增厚相關因子(cardiac hypertrophy related factor, CHRF)高水平表達，lncRNA-CHRF干擾miR-487，抑制其與髓樣分化因子88(Myd88)的結合，而Myd88介導下游轉錄因子NF-kB[13]，參與心肌增厚的信號傳導，結果導致心肌細胞的肥大。

Greco等[14]在對照非終末期心力衰竭病人與健康組成人的左心室心肌細胞時，發現有9種lncRNA(CDKN2B-AS1/ANRIL、 EGOT、 H19、 HOTAIR、 LOC285194/TUSC7、 RMRP、 RNY5、 SOX2-OT和SRA1)在非終末期的調節水平與終末期一致，且都表達下調。另外，在心血管疾病中，心肌梗死因為部分心肌細胞的急性缺血而對患者造成嚴重的威脅。Zangrando等[15]曾發現并命名了心肌梗死相關轉錄物lncRNA-MIRT。他利用原位雜交技術，基因間lncRNA-MIRT被定位在心肌梗死模型鼠的左心室，并且MIRT1和MIRT2的表達水平的分別提高了5倍和13倍。進一步研究發現，MIRT的劑量與射血分數正相關，而與梗死面積負相關。

2.3 lncRNA與神經退行性疾病 lncRNA可調控神經干細胞(neural stem cell, NSCs)的定向分化。NSCs具有可分化成神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞的潛能，而一些lncRNA在中樞神經系統的表達具有細胞和組織的特異性。研究發現，Dlx5/6基因間的增強子轉錄形成3.8 kb的lncRNA Evf-2，通過與Dlx-2結合并使后者活化，招募CpG甲基結合蛋白2(methyl CpG binding protein 2， MECP2)、DLX等轉錄因子與Dlx5/6基因結合，提高Dlx5/6的表達，是促進NSCs向γ-氨基丁酸神經元分化的關鍵因子[16]。研究還發現，lncRNA-RMST、 lncRNA-N1、 lncRNA-N2和lncRNA-N3能通過結合表觀沉默蛋白SUZ12和神經元限制性沉默因子(neuron-restrictive silencer factor, NRSF)，激活下游通路而促進NSCs向神經元分化，為研究NSCs定向誘導成多巴胺能神經元、并用以治療帕金森病提供了理論依據。

阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease, AD)是嚴重影響生活質量、且發病率較高的神經退行性疾病。其發病的機制之一是β分泌酶1(β-site of APP cleaving enzyme 1, BACE1)能夠使淀粉樣蛋白前體(amyloid precursor protein, APP)斷裂而產生突觸毒性物質Aβ，Aβ42大量累積形成大腦皮質老年斑。而BACE1的反義轉錄物BACE1-AS可以緩解這一過程,這是明顯的反饋—應激的機制。Liu等人[17]利用siRNA技術沉默了AD老年斑lncRNA BACE1-AS的表達，結果表明BACE1的異常剪切APP的能力明顯下降，Aβ42的生成量也隨之減少。由此推測，lncRNA BACE1-AS可能是形成Aβ的關鍵因子。

2.4 lncRNA與自身免疫疾病 自身免疫疾病常包括系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis， RA)、I-型糖尿病(type 1 diabetes mellitus， T1DM)、銀屑病(psoriasis)等，這些疾病的致病機理大致相同，而SLE、 RA等常伴隨著慢性的關節炎癥反應。SLE是一類先天性免疫和獲得性免疫共同調控的復雜免疫疾病。lncRNA-Gas5可能通過競爭性結合GR而阻斷GR下游信號的轉導[10]，當GAS5表達量提高時，則會削弱糖皮質激素對SLE患者的治療。lncRNA-NFAT1在SLE患者外周血的單核細胞中濃度較高，這主要與炎癥反應密切相關。Zhang等[18]的研究發現，NFAT1的表達可激活p38/MAPK通路，從而導致白介素-6(IL-6)、趨化因子-10(CXCL-10)等炎癥因子的大量聚集。

RA的臨床表現主要為手足等關節的僵硬、畸形，異常表達的lncRNA主要存在于RA患者的外周血和關節滑液中。Song等[19]利用微矩陣技術，發現至少有Hotair、 LUST和MEG9等七種lncRNA在RA患者體的內表達上調。同時高劑量的Hotair活化巨噬細胞，低劑量的Hotair卻激活MMP-2、 MMP-3等基質蛋白酶，lncRNA可能作為有效診斷RA的標志物。在小鼠胰腺癌細胞(MIN6)中表達大量的lncRNAs，這些lncRNA被定位在胰島，并且在非肥胖型糖尿病小鼠(NOD)的患病前期高水平表達。其中的lncRNA-3和lncRNA-4能夠跟腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-61β(IL-1β)等炎癥因子共同調節胰島細胞的凋亡[20]。

3 結語

lncRNA在發揮其功能的過程中，與各種疾病的發生與遷移有著密切的聯系，這已經成為近年來疾病機制研究的重點領域，而對lncRNA的結構與功能的深入了解，則有望為疾病的治療提供新的思路。