I型干擾素在犬類疾病病原學及治療方面的研究進展

胡文 馮珣 張寶寶 閆志偉 徐玉生 劉永生

（1. 甘肅警察職業學院，蘭州 730046；2. 公安部南昌警犬基地，南昌 330100；3. 中國農業科學院蘭州獸醫研究所，蘭州 730046）

固有免疫（Innate immune responses）和適應性免疫（Adaptive immune responses）是機體免疫系統抵御外界病原微生物入侵的重要免疫學屏障。I型干擾素（Interferon，IFN）是一類在抗擊病原微生物（尤其是病毒侵染）過程中發揮關鍵作用的免疫因子。當相關細胞因子產生后，IFN激發的信號通路通過自分泌（Autocrine）和旁分泌（Paracrine）通路發揮抗病毒作用。I型IFN主要通過抑制病毒復制來發揮直接的抗病毒活性，并且可以激活和調節機體天然免疫與適應性免疫系統的細胞免疫功能，因此I型干擾素在病毒感染早期發揮抑制作用并且可發揮長期免疫功能。自1958年，I型IFN作為抗流感病毒復制的一種免疫活性物質而被人們所關注，此后不斷發現I型IFN家族成員，其中包括IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-ε、IFN-ζ、IFN-κ、IFN-τ及 IFN-ω［1］，同時也闡明了I型IFN的活化機制和介導下游免疫因子生發的信號通路。值得注意的是，犬類動物的基因組中尚未發現 IFN-ζ、IFN-δ、IFN-τ及 IFN-ω編碼基因的存在。隨著犬類動物的進化歷程，犬類IFN-α編碼基因通過突變進化出了10種具有相似免疫學活性的IFN-α亞基因群以及2個無功能活性的假基因片段。這些基因與IFN-ε和IFN-κ編碼基因臨近，都存在于犬類細胞核中第11號染色體上［2］。早在1986年，IFN-α就已經被美國食品藥品管理局批準用于臨床治療，但是大約15%的臨床患者在接受IFN治療過程中能夠產生特異性抗體，從而極大削弱了IFN作為臨床藥物的療效［3］。目前，I型IFN主要用于治療晚期毛細胞白血病、腎癌、黑色素瘤、Kaposi肉瘤、慢性粒細胞性白血病和中低度惡性非霍奇金淋巴瘤，同時也用于急、慢性丙型病毒性肝炎，慢性活動性乙型肝炎的臨床治療。相對于I型IFN在人類臨床疾病的應用歷史，特異性I型IFN用于特定動物疾病的臨床治療起步較晚，這主要受到治療成本的限制。犬類動物作為人類的伴侶動物，特異性I型IFN對一些犬類疾病的臨床治療起步較早，這其中包括犬類中樞神經系統性疾病、犬瘟熱等［4］。這種由免疫因子介導的臨床治療在犬類疾病的治療方面具有潛在的應用價值。因此，研究I型IFN在介導機體免疫反應方面所涉及的信號通路以及免疫效應，將對研發犬類疾病的IFN臨床制劑具有指導性作用。

1 I型IFN的信號通路

免疫系統是通過能夠感受外源DNA或者RNA的模式識別受體來檢測侵入機體細胞的病原微生物，從而實現免疫細胞與機體其他類型細胞進行信息交流以及介導下游抗感染信號通路的激活。與其他免疫活動類似，IFN相關的信號通路也是依賴免疫細胞表面受體接受病原微生物在機體產生的不同信號分子信號，進而通過細胞膜來產生一系列的胞內生物化學反應。固有免疫反應（Innate immune response）可以通過病原相關模式分子（Pathogenassociated molecular pattern，PAMP）與模式識別受體（Pattern recognition receptor，PRR）的結合而被激活。這些PRR受體包括Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）、RIG樣受體及MDA5受體等。這些受體是利用特定的分子接頭（如MyD88分子及TRIF分子）傳遞信號并激活與IFN轉錄相關的轉錄因子（如IRF3、IRF7及NF-κB）進行轉錄的。這些轉錄因子從細胞質進入細胞核后能夠激活I型IFN、前炎性因子與趨化因子基因的轉錄活性，從而產生相應的蛋白產物。通過分析不同IFN轉錄因子序列在不同動物體內的相似性，包括犬類動物在內的大多數哺乳動物擁有高度相似的IFN轉錄因子序列［5-6］，這也進一步說明現已研究發現的IFN信號的分子機制可能同樣適用于犬類動物體內IFN的免疫調節過程。IFN結合到特定的細胞受體上就可以激活具有廣譜抗病毒免疫通路（JAK-STAT通路）。STAT1與STAT2蛋白被磷酸化修飾后與IRF9分子結合構成干擾素刺激基因因子3（Interferon stimulated gene factor 3，ISGF3），而后入核誘導數百種干擾素刺激基因（Interferon stimulated gene，ISG）轉錄活化。I型IFN誘導ISG的轉錄，包括IRF7在內的干擾素刺激基因，與IRF3基因共同通過正反饋循環上調IFN α/β的表達，進而使機體處于對病原微生物的免疫防御狀態。然而病原體在應對機體免疫系統的免疫抵抗活性過程中已經進化出了多種免疫逃避機制，包括感染犬類動物在內的許多病毒已經進化出了一套完整的免疫逃避機制來干擾ISG與IFN互作對病毒復制的影響［7］。

2 I型IFN的誘導物

在研究IFN功能活性和免疫機制的初期，研究人員利用人工合成的雙鏈RNA對IFN的產生機制以及下游信號傳遞事件進行了一系列的研究。其中，分別對來源于犬類動物、靈長類動物、嚙齒類動物和反芻類動物的原代腎臟細胞利用適量的poly I：C進行處理，所有細胞均能夠穩定產生IFN［8］。與其他哺乳動物體細胞相比，犬類細胞對poly I：C復合物刺激所產生的免疫反應是很弱的［9］。此外，在研究人源IFN在不同物種細胞中的免疫學效應的過程發現，犬類、貓科、反芻類和偶蹄類動物源細胞均對人源IFN不敏感［10］。進一步研究發現，I型IFN的免疫學和生物學活性是嚴格依賴于器官組織的類型而并非是物種器官的類型［11］。誘導IFN產生來治療感染性疾病，已經是臨床治療動物或者人類疾病的一種有效方法。在19世紀70年代，鹽酸替絡龍（Tilorone hydrochloride）已經在病毒感染小鼠模型中作為一種口服IFN激活劑來進行使用。此后，在不同的動物模型中發現，這種誘導刺激物在增強NK細胞活性、抑制纖維化、抗炎癥和抗腫瘤方面都有很好的效果［12］。鹽酸替絡龍已經在人類感染流感病毒、肝炎病毒以及皰疹病毒中被選為臨床治療藥物。雖然此類IFN誘導劑并沒有在家畜疾病的臨床治療中使用，但是在緩解犬類和貓科動物異體移植方面所產生的排異反應方面的治療運用較廣［13］。研究還發現中藥玉屏風散的活性成分可以有效激活犬腎細胞的IFN免疫活性，從而有效抵抗流感病毒的侵染［14］。這一研究成果為臨床獸醫利用傳統中醫藥對犬類疾病進行臨床治療提供了有價值的參考信息。

3 重組I型IFN的作用

在研究犬類動物免疫學分子機制初期，重組人源IFN（Recombinant human IFN）作為免疫激動劑來進行相關分子機制的研究。研究發現重組人源IFN可以對犬類動物產生劑量依賴性的B細胞分化抑制效應以及提高T細胞的免疫活性，進而使細胞大量分泌IL-2［15］。重組人源IFN能夠抑制犬類細胞的體外增殖分化，并且有效抑制單純皰疹病毒在犬類細胞中的增殖，然而其他動物源性的IFN（例如豬源IFN、雞源IFN和鼠源IFN）均無法刺激犬類細胞產生針對單純皰疹病毒侵染的抗病毒活性［16］。研究人員已經在大腸桿菌中實現了重組犬源IFN 的活性表達，其表達產物可以激活鼠成纖維細胞和神經元細胞的JAK-STAT信號通路［17］。隨著對犬源IFN表達系統的建立及優化，實現了大腸桿菌作為表達系統將帶有不同標簽的重組犬源IFN高效表達，并且這些具有活性的犬源重組IFN表達產物具有針對犬類病毒病良好的臨床治療效果［18］。令人振奮的是，重組犬類IFN-ε似乎具有相對廣泛的宿主嗜性抗病毒功能，不僅對同源/異源犬腎細胞還是對HeLa細胞和貓腎細胞都具有良好的抗病毒功能，這些研究結果為利用重組犬源IFN-ε作為臨床制劑提供了理論依據［19］。

4 犬源I型IFN及ISG的免疫學功效

I型IFN的生物學功能主要體現在調節細胞增生與分化、參與機體免疫反應、抑制血管再生以及激活細胞凋亡［20］。I型IFN激活固有免疫與適應性免疫反應，從而提高抗原遞呈、細胞因子與趨化因子生成的能力、提升B細胞抗體合成量、T細胞與自然殺傷細胞的免疫效應［21］。由于I型IFN具有抑制多種細胞的內吞作用（由此可以阻止很多胞內菌或者具有內化作用的病毒侵入），因此臨床上已經廣泛用于慢性丙型肝炎及癌癥的治療。在犬類疾病的臨床治療過程中，人們發現犬骨髓、脾臟、胸腺、胸腺及淋巴結相關的細胞均可在體外培養條件下由病毒或者非病毒誘導物刺激產生I型IFN［22］。犬感染犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）16 d后仍然可以在中樞神經系統檢測出I型IFN的存在，這也就為臨床上評估患犬是否持續性感染CDV提供了免疫學標識。而小鼠實驗研究發現，中樞神經系統中的星型膠質細胞、室管膜細胞和神經元都具有分泌I型IFN的免疫學功能［23］。在犬漸進性青光眼的診療中，I型IFN等相關免疫因子的基因表達及轉錄水平的分子檢測也已經有了新的進展。

此外，ISG在犬類免疫反應的過程中同樣發揮著決定性作用，研究人員對ISG的研究主要集中在犬源黏液病毒抗性蛋白（Myxovirus resistance protein，Mx）與 2’，5’-寡腺苷合成酶（2’，5'-oligoadenylate synthetase，OAS）的免疫活性功能。犬源Mx1蛋白與Mx2蛋白主要定位于細胞膜。與人源Mx2蛋白相比，犬源Mx2蛋白通過顆粒樣聚集而非游離的形式插入細胞膜來進行抗病毒反應［24］。犬源Mx蛋白具有廣泛的抗感染作用，主要表現在抗病毒、抗原生質致病微生物、抗霉菌及特發性犬腦炎引起的神經紊亂。雖然犬源Mx蛋白的抗感染的機制還不是很清楚，但是參考人源Mx蛋白的作用機制不難發現Mx蛋白通過與病原微生物結合或者干擾病原微生物的相關轉錄過程來發揮抗感染的免疫學功能［25］。犬源OAS可以識別雙鏈RNA并激活RNaseL蛋白的活性，從而降解病毒轉錄物以及阻止病毒蛋白的合成。研究發現雌性比格獵犬在感染病原微生物后，其血清中OAS的含量比貓科動物所產生的量高出10-100倍，這也暗示了犬源OAS蛋白產物在保護犬類動物抵御致病微生物的侵襲提供了堅固的免疫防線，而OAS的這一免疫學特點尤其在犬瘟熱病毒的感染中發揮著重要作用［26］。

5 I型IFN在犬類疾病臨床治療中的應用

由于IFN具有抗病毒、抗腫瘤及免疫調節的免疫學效應，I型IFN已經受到人類醫學及動物醫學的青睞。在犬多發性乳頭瘤?。–anine papillomatosis）及犬膿皮?。–anine pyoderma）治療中，I型IFN作為免疫制劑具有理想的臨床療效。利用重組人源IFN-β進行膀胱灌注的方式來進行犬膀胱癌的臨床治療發現，重組人源IFN-β對犬無臨床療效，因此需要依賴犬類IFN開展相關臨床治療的探索研究。利用犬源I型IFN來對侵入MDCK細胞的犬新孢子蟲速殖子進行處理后可有效的抑制速殖子的增殖。將I型IFN制成口服制劑并且低劑量給犬灌服后，可有效降低犬口腔中引起牙周病的細菌載量，并且增強牙齦炎性反應的程度來實現抗菌活性［27］。這是因為I型IFN能夠激活口腔黏膜組織中的淋巴細胞來產生內源性IFN，從而增加抗原特異CD4+與CD8+的含量。對I型IFN在比格獵犬體內藥代動力學的研究表明，口服I型IFN后，比格獵犬血清中IFN的濃度低于靜脈注射I型IFN后血清中所產生IFN的濃度，同理，皮下注射途徑與肌注效果也只能達到靜脈注射途徑IFN在血清中濃度的42%。這些研究表明，IFN通過靜脈注射途徑更能迅速提升犬體內用于臨床治療IFN的有效濃度。鑒于I型IFN生物活性的半衰期只有大約4.5-9.5 h，建議采用靜脈注射的方式對犬類疾病進行臨床治療。但是，在利用IFN作為犬類疾病的臨床治療藥物的過程中也發現很多不足之處，如犬用IFN制劑的價格過高、注射所產生的IFN中和性抗體不確定性等。為降低犬類動物對外源IFN所產生中和抗體而削弱IFN的臨床療效，研究顯示在IFN與他克莫司（一種免疫抑制劑）（0.1 mg/kg）聯合使用的情況下，比格獵犬體內可有效抑制針對IFN的中和抗體的產生且增強T細胞的增殖分化［28］。

5.1 I型IFN作為抗癌藥物的應用

早在20世紀70年代，人們就利用I型IFN所具有的抗細胞增殖的生物學特性來進行淋巴瘤、黑色素瘤與骨肉瘤治療的臨床治療試驗。這些臨床試驗所取得的進展也促使犬類獸醫工作者利用I型IFN來臨床治療犬類腫瘤性疾病，這其中就包括了利用人源IFN與鈷-60處理體外犬類腫瘤細胞的實驗，且臨床療效明顯?？傊?，IFN在體外抗腫瘤實驗表明，臨床用IFN對由圓形細胞瘤分化來的細胞比從實體瘤而來的細胞的臨床療效明顯。利用人源IFN-α來治療患有上皮樣淋巴瘤的病犬可使病犬臨床癥狀快速消失，并且可使療效保持10周左右。鑒于IFN-α具有抑制血管內皮生長因子及成纖維細胞生長因子的生物學特性，IFN-α被應用于犬血管瘤的臨床治療中［29］。利用犬源IFN-β治療犬纖維素瘤、骨肉瘤、黏液肉瘤以及脂肪瘤可以明顯阻止瘤體在病灶部的復發，明顯延長了患犬的生存期。在人源或者犬源黑色素瘤的體外培養物中導入IFN-β基因后，表達產物可明顯增加細胞毒性作用，這為利用IFN編碼基因進行臨床基因治療犬類腫瘤性疾病提供了實驗依據［30］。此外，研究發現貓源IFN-ω同樣對于犬類的一些腫瘤細胞具有抑制其增殖的功效。

5.2 I型IFN作為抗病毒藥物的應用

在研究IFN如何抑制流感病毒復制的過程中發現，多種由I型IFN激活表達的ISG具有很強的抗病毒活性。例如，TRIM22分子促進流感病毒核衣殼蛋白的降解，MxA能夠阻斷核衣殼蛋白的細胞定位活性以及流感病毒基因組的復制。然而，流感病毒可以在MDCK細胞內正常增殖說明犬源Mx分子不具備抑制流感病毒復制的能力。進一步研究發現，犬源流感病毒可激活患犬體內IFN-β的合成，以及包括Mx1、Mx2、TRIM22、ISG5、DDX58及OAS1-3在內的一系列ISG基因的活性。進一步研究發現，犬流感病毒NS1通過阻斷IRF3與NF-κB的信號通路來使迅速合成的IFN-β喪失抗病毒活性［31］。將重組人源IFN-α 2b滴入患犬鼻腔黏膜處，可犬流感病毒在患犬呼吸道中的增殖被有效抑制，這也為利用I型IFN針對犬呼吸道疾病的臨床治療提供了參考依據。相比流感病毒對犬類動物免疫系統的激活程度，犬乳頭瘤病毒無法刺激機體產生I型IFN，由此導致的結果是與之相關的ISG無法表達以及無法活化炎性因子前體。然而利用人源IFN-α 2a對迷你雪納瑞犬和斗牛犬進行1-2年的持續治療后，發現由乳頭瘤病毒引起的表皮色斑面積減小并且復發的幾率降低。在IFN-α與病毒唑聯合用藥治療后，CDV的復制被明顯的抑制。雖然其中的抗病毒機制還不是十分明晰，但這種聯合用藥的治療方法為治療CDV感染提供了一種臨床治療思路。與上述犬類病毒病相比，I型IFN在犬細小病毒的臨床治療方面是最為成熟的，早在20世紀90年代人們就利用IFN-ω來進行臨床治療并取得了很好的療效。

5.3 I型IFN在先天性疾病及免疫調節治療方面的應用

一些研究者嘗試將I型IFN具有的免疫調節功能轉移到對犬類動物先天性疾病的臨床治療中。由免疫調節引起的干燥型角膜結膜炎的病犬在口服人源重組I型IFN后，臨床療效表現為患犬眼部變得濕潤并且減弱了分泌物的黏滯性。利用人源重組I型IFN臨床治療復發性淺表膿皮病的患犬，也有助于減輕臨床癥狀。特異性皮炎是犬類的過敏性疾病，這是由外界過敏原刺激犬體內IgE抗體的產生導致的，針對此類疾病的臨床治療所取得的進展對人類的這種疾病具有很好的指導意義。因為這類過敏性疾病無論是在犬還是人發生，這都是由于體內免疫相關基因的異常轉錄以及IFN基因相關的調節因子功能紊亂造成的［32］。有趣的是，貓源IFN-ω無論是口服還是皮下注射均對犬特應性皮炎的臨床治療中也能發揮良好的治療作用，這可能是因為貓源IFN-ω顯著提高了皮膚對瘙癢耐受能力以及降低了皮損的敏感程度［33］。

6 展望

自從I型IFN被發現以來，其卓越的抗病毒功能及免疫調節活性一直是研究的熱點，并且在臨床治療研究中也具有重要的研究地位。由于其具有抗病毒、抗增生及免疫調節等功能，包括犬類動物在內的很多動物疾病均有I型IFN在臨床中用于治療的案例。然而，在諸如犬細小病毒引發的小腸炎的臨床治療過程中發現，I型IFN的實際療效還需要通過大量動物實驗進行系統評估。此外，I型IFN體外表達所產生的醫學成本也是令獸醫臨床工作者望而卻步的一個重要原因，這需要人們努力研發出成本更低廉的表達系統，以擴大期在動物疫病治療領域中的作用。