核移植介導的哺乳動物體細胞核重編程研究進展

吳霄 莊站偉 馬曉莉 黃思秀 李紫聰 徐錚

（華南農業大學 國家生豬種業工程技術研究中心 動物科學學院 實驗動物中心，廣州 510642）

體細胞核移植技術（Somatic cell nuclear transfer，SCNT），也稱克隆，是一種利用體細胞潛在的發育全能性去獲得新的個體的技術。自1997年世界上第一例克隆羊“多利（Dolly）”出生至今，已有20多種哺乳動物被成功克隆出來，而2018年報道的世界首例克隆猴更是對靈長類動物研究的重大突破［1-2］。SCNT存在巨大的應用價值，如種質資源保護、良種擴繁、實驗動物生產，以及以器官移植為目的的治療性克隆?？寺『锏某晒σ彩筍CNT在研究人類阿爾茲海默癥、亨廷頓舞蹈癥等疾病上的應用更近一步。

盡管SCNT在生命科學領域取得了一些成就，但該技術仍然存在巨大的應用缺陷。據統計，哺乳動物的SCNT胚胎的體內發育效率約1%-5%（出生數/卵裂期胚胎移植數），且克隆產生的后代往往出現死亡率極高和諸多發育缺陷的現象，如巨胎癥、呼吸道疾病、免疫缺陷等［3-4］。在過去20年里，各國學者對SCNT的操作流程進行了各種優化，但這對提高克隆效率的作用甚微，阻礙SCNT胚胎正常發育的原因主要來自于胚胎自身發育過程中出現的供體細胞核重編程異常［5］。受精胚胎的重編程是指高度分化的精子和卵母細胞在形成受精卵后，胚胎的核發生一系列變化，恢復細胞發育的全能性，以指導胚胎的發育過程。但是SCNT胚胎的形成有別于受精胚胎，供體細胞核需要恢復其發育全能性以指導重構胚的正常發育，但這個過程存在著諸多障礙，尤其是表觀遺傳水平的重編程錯誤，最終只有極少數的胚胎能夠正常發育、附植和出生。本文通過與受精胚胎的比較，重點介紹了哺乳動物SCNT胚胎中的供體細胞核重編程異?，F象及其表觀遺傳修復機制的研究進展，并對一些與發育過程中的重編程相關的細胞和分子事件進行探討。

1 早期SCNT胚胎的發育過程

供體細胞與去核卵母細胞形成重構胚的過程主要包括注射、融合和激活3個步驟。這期間，重構胚發生了一系列變化。供體細胞核進入卵母細胞質后，核膜迅速破裂（Nuclear envelope breakdown，NEBD），失去核膜的染色體由存在于卵母細胞質中的M期促進因子（M-phase-promoting factors，MPFs）促發染色體超前凝聚（Premature chromosome condensation，PCC）。在PCC期間，結合于染色體上的蛋白質會發生解離［6］。供體細胞和去核的卵母細胞融合后，通過電激活等物理方法和氯化鍶、鈣離子激活等化學方法激活卵母細胞，完成第二次減數分裂。重構胚激活后重新形成核膜，并開始進行DNA復制，在此期間由于重構胚的細胞核加入大量卵母細胞的蛋白質，染色質結構和蛋白質結合發生急劇變化［7］。隨著合子基因組激活（Zygotic genome activation，ZGA）的啟動，重構胚基因組逐漸恢復其轉錄，卵母細胞胞質中儲存的RNA很快降解并由新合成的RNA取代，啟動染色體重塑和其他表觀遺傳修飾的重編程。

2 核移植后的表觀遺傳修飾變化

SCNT后基因組發生的表觀遺傳修飾事件主要包括染色質重塑、DNA甲基化、組蛋白修飾、印記基因的表達、X染色體失活等過程。

2.1 染色體重塑

染色體結構的改變與D NA復制、DNA重組、基因表達等生物學過程緊密相關。多能性細胞的特征在于比高度分化的體細胞具有更開放的染色質狀態［8］。胚胎發育過程中，基因組形成大量的染色體開放區域促使位于該開放區域的關鍵調控元件介導胚胎基因組轉錄的啟動。此過程中，一些轉錄因子會與封閉的染色質區域結合，打開染色質，如Oct4、Sox2、Kif4［9-10］。在 SCNT胚胎中，供體細胞染色體也需要通過重塑來啟動胚胎的發育全能性［11］。Djekidel等對1細胞期的體外受精胚胎和SCNT胚胎以及作為供體的卵丘細胞進行基于微量樣品的DNase I超敏感位點測序（low-input DNase I hypersensitive sites sequencing，liDNase-seq）， 發 現SCNT胚胎染色質重塑主要在激活后12 h內完成，但是，與受精胚胎相比，SCNT胚胎的大量DNaseI超敏感位點在供體細胞核重編程過程中丟失［12］。誘導多能性干細胞的實驗中也發現，體細胞中的轉錄因子，如AP-1家族成員Jun，會通過阻止Oct4、Sox2、Kif4的作用來抑制供體細胞核的重編程［13］。另一項研究表明與受精胚胎相比，SCNT胚胎在染色質重塑的過程中部分區域未能成功進行重編程，而這些區域伴隨著H3組蛋白第9位賴氨酸三甲基化（Histone3 lysine9 trimethylation，H3K9me3）和 DNA甲基化的富集，阻礙SCNT胚胎的重編程［12］。

2.2 DNA甲基化

DNA甲基化是生物體基因組中的一個重要表觀遺傳修飾，其中，5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）是哺乳動物中的主要甲基化模式。5mC的建立與維持是通過DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）進行；而甲基化的擦除則是通過雙加氧酶（Ten-eleven translocation，TET）介導將胞嘧啶上的甲基氧化為羥甲基、醛基和羧基，然后通過DNA糖基化酶進行堿基切除修復［14］。在胚胎發育早期，受精卵會發生廣泛的去甲基化，其中父本基因組主動去甲基化，母本基因組被動去甲基化，基因組的低DNA甲基化狀態為胚胎的全能性奠定了分子基礎［15-16］。SCNT胚胎基因組的甲基化狀態來源于其供體細胞，在重編程過程中去甲基化不完全，多數啟動子仍然維持高甲基化。精子的染色質結構與供體成纖維細胞核之間的差異可能限制了SCNT中去甲基化機制的進行［17］。

通過小分子化合物DNA甲基化轉移酶抑制劑，如 5-氮 雜 -2'-脫 氧 胞 苷（5-aza-2'-deoxycytidine，5-aza-dc）、zebularine、RG108等，降低供體細胞或胚胎基因組的甲基化水平是提高克隆效率的一個重要方法。通過5-aza-dc、zebularine處理供體細胞或SCNT胚胎的研究在小鼠、豬、牛等物種中都取得了一定的成果，成功降低了DNA甲基化的水平并在一定程度提高了SCNT胚胎的發育效率［18-21］。但是5-aza-dc 這類化合物對細胞具有毒性，對細胞生長存在危害。與之相比，RG108沒有細胞毒性或遺傳毒性作用，是一種較為理想的處理藥物。Zhai等［22］利用RG108處理后的豬胎兒成纖維細胞作為供體細胞，成功提高了SCNT胚胎的囊胚率（24.72% vs. 18.38%）。另一方面，TET介導的去甲基化作用也可以降低基因組中的DNA甲基化水平，TET3介導的DNA去甲基化涉及受精卵中父本DNA的表觀遺傳重編程，對于重構胚的發育非常重要。研究表明，卵母細胞中儲存的TET3可以使小鼠SCNT胚胎的DNA甲基化得到擦除，而SCNT胚胎在重編程過程中的TET3不足似乎是無法支持完整去甲基化的一個重要原因［15，23-24］。Han 等［25］通過在供體細胞中過表達TET3成功提高了克隆山羊的出生率（3.6% vs. 1.5%）。高紹榮教授團隊的最新研究發現，小鼠SCNT胚胎去甲基化過程中存在再次甲基化的現象，已經降低的基因組甲基化水平在二細胞期的SCNT胚胎中會再次提高，至四細胞期重新降低［26］。該研究在SCNT胚胎的2細胞階段還檢測到內源性逆轉錄病毒（Endogenous retroviruses，ERV）的長末端重復序列元件中存在異常DNA甲基化狀態［26］。由于ZGA通常以ERV的激活為特征，上述發現正好驗證了SCNT胚胎未能進行完整的ZGA的假設［27］。因此，Gao等［26］向去核卵母細胞注射了靶向DNA甲基化轉移酶的小干擾RNA，阻礙DNA甲基化轉移酶的表達，抑制了DNA重新甲基化，成功提高了小鼠SCNT胚胎的出生率（5.33% vs. 0.88%）。由于DNA去甲基化模式與發生階段在各個物種中是不保守的，這種在小鼠SCNT胚胎中重新甲基化的現象在其他物種中是否保守還有待驗證。

2.3 組蛋白修飾

組蛋白的氨基末端位于核小體的核心結構之外，作為一個信號位點與基因的轉錄調控密切相關。組蛋白修飾是指組蛋白的氨基末端與各種調節蛋白發生各種共價修飾，包括甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化等，不同的修飾模式對基因表達有不同的調控作用［28］。在正常受精胚胎發育早期，母本基因組組蛋白維持原有狀態，而父本基因組組蛋白呈現高度乙?；?9-30］。而在SCNT胚胎中，激活后的組蛋白修飾狀態由供體細胞的狀態向類似于受精胚胎的狀態發育，但此前的研究發現，相比受精胚胎，SCNT胚胎始終保持著與供體細胞核相似的低水平的H4組蛋白第5位賴氨酸乙?；℉istone4 lysine4 acetylation，H4K5Ac）和高水平的H3K9me3。因此，糾正異常的組蛋白修飾狀態可能能夠改善胚胎的發育狀態。

通過組蛋白去乙?；敢种苿℉istone deacetylase inhibitor，HDACi）， 如 TSA、LAQ824 和 quisinostat等，調節組蛋白乙?；娇梢杂行Ц纳芐CNT 胚胎的發育效率［31-36］。Jin 等［36］利用 quisinostat處理SCNT胚胎，顯著提高了SCNT胚胎的囊胚率（19.0% VS 10.2%）。另外，組蛋白乙?；虳NA甲基化可能是作為相互獨立的重編程障礙存在。一些研究利用TSA和5-aza-dc共同處理SCNT胚胎，在提高組蛋白乙?；耐瑫r降低DNA甲基化水平，在小鼠、牛等物種上都取得了一定的效果［37-39］。H3K9me3修飾作為轉錄抑制的標記，已被證實是表觀遺傳修飾重編程的主要障礙之一。Matoba等［40］首先通過過表達組蛋白去甲基化酶Kdm4d去除SCNT胚胎的H3K9me3，將克隆小鼠的出生率提高了7-8倍（1% vs. 8.7%）。類似的方法在人、猴、牛、豬身上都取得了一定的成果，但效果不如小鼠的顯著［2，41-43］。Yang 等［44］發現一些關鍵的發育基因在胚胎內細胞團中受到H3K27me3的調節，而在外胚層細胞中被DNA甲基化沉默，這種修飾模式的組合有利于維持和調節胚胎發育的可塑性，同時也說明了H3K27me3和DNA甲基化是促進胚胎重編程的重要表觀異常修飾。張毅團隊最近的研究則表明，H3K27me3修飾也是一種供體細胞核重編程的主要障礙［7］。由于SCNT胚胎在重編程過程中未能建立完整的H3K27me3修飾，從而導致一系列印記基因的異常表達并使胚胎發育阻滯［45-46］。

2.4 印記基因

基因組印記是指通過表觀遺傳修飾控制某些特定的等位基因僅表達來自父本或母本一方的基因的現象，這類等位基因被稱為印記基因。印記基因的表達具有時空特異性，即從原始生殖細胞發生到生物生長期間，基因組需要根據發育階段和組織的不同建立、維持、擦除印記，控制印記基因的表達［47］。

研究發現，在SCNT胚胎中，存在印記基因異常表達的現象，如表達量異常、錯誤表達或不表達等。Wei等［48］在異常死亡的初生克隆豬胎盤中檢測到IGF2，H19，PEG3和GRB1的表達量異常。Yang等［49］在死亡克隆犢牛的8個器官中發現了IGF2，IGF2R和H19的表達量異常。Hiroaki等［50］利用RNA測序鑒定出克隆小鼠的胎盤中Sfmbt2、Gab1、Slc38a4等印記基因出現雙等位基因表達的狀態。由于印記基因的功能往往與胎兒生長發育相關，因此印記基因的表達異常也是導致SCNT胚胎異常發育的主要原因之一。

了解基因組印記對印記基因表達模式的調控將有助于糾正SCNT胚胎中印記基因的異常表達。其中，DNA甲基化是哺乳動物中的主要基因組印記。印記基因中的部分CpG島在父母本基因組中具有顯著的DNA甲基化差異，稱為差異甲基化區域（Differentially methylated region，DMR）。DMR 是印記基因的單等位基因表達的決定因素，能夠維持印記基因在父母本中的差異表達。Hiroaki等［50］通過檢測DMR的DNA甲基化水平驗證了SCNT胚胎中Gab1等印記基因的異常表達。Yu等［51］發現父本印記基因RTL1是影響豬SCNT胚胎早期流產的關鍵基因，由于RTL1在SCNT胚胎中的DNA甲基化印記未能正常擦除，抑制了其正常表達，而通過對RTL1進行劑量補償表達，可以顯著地提高SCNT胚胎移植受體的懷孕率。與DNA甲基化相似的，組蛋白修飾也可以作為基因組印記控制印記基因的表達，Wee等［31］發現印跡基因NDN和XIST在克隆牛胚胎中的異常表達與H4K5Ac相關，這說明H4K5Ac可能是一種基因組印記。另外，H3K27me3修飾也被確認是一種位于母本基因組上的印記，Inoue等［52］認為H3K27me3修飾在卵子發生過程中逐漸建立并成為印記基因的印記，同時在植入前胚胎中母本H3K27me3的擦除會誘導X染色體失活。

2.5 X染色體失活

X染色體失活（X-chromosome inactivation，XCI）是指在哺乳動物中，雌性個體選擇性失活一條X染色體來保證雌雄個體在X染色體連鎖基因的基因表達量的一致性的過程［53］。在雌性的受精胚胎發育過程中，X染色體會始終保持一條染色體失活。早前的研究在SCNT胚胎中檢測到X染色體存在異常表達，胚胎細胞中出現了一條、兩條激活的X染色體或沒有染色體激活的現象［54］。由于XCI主要通過印記基因Xist轉錄長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，lncRNA）并包裹X染色體形成，因此XCI的異常一般是Xist基因的異常表達引起的。研究表明通過敲除或干擾Xist基因可以有效的糾正異常XCI，并顯著提高小鼠的克隆效率［55］。同時這種方法對大型哺乳動物克隆效率的提高也起到了一定的效果［43，56-57］。但是敲除Xist基因的方法對克隆動物的生長及繁育有巨大的弊端，糾正Xist異常激活的機制并維持單個X染色體激活才是更持續性的策略。研究發現，Xist在卵母細胞中一直保持沉默直到胚胎激活后才被激活，傳統的觀點認為這期間Xist的母本印記是DNA甲基化。但是近年的研究表明Xist的母本印記與另外兩種印記有關，即H3K9me3 和 H3K27me3［52，58］。這兩種印記都是通過在Xist上富集來抑制該基因的表達，但在SCNT胚胎中均檢測到兩種印記的喪失。這些研究暗示通過建立印記沉默Xist可能是維持單個X染色體正常激活的有效措施。

3 其他重編程事件

除了上述幾種表觀遺傳修飾機制，還有許多其他的重編程事件被證明與胚胎發育相關，如端粒長度的維持、lncRNA的調控、ERV的轉錄激活，這些重編程活動可能也會影響SCNT胚胎的正常發育。端粒在細胞分裂過程中會逐漸縮短，當到達某個閾值時，細胞會停止分裂并進入死亡程序。研究發現，克隆羊Dolly的端粒長度僅為正常長度的80%，同時在豬、牛等其他物種中也發現克隆后代端?？s短的現象［59-61］。端粒長度的維持和延長需要端粒酶同端粒結構的結合來進行，而端粒結構又受端粒表觀遺傳修飾的調節［62］。因此，SCNT胚胎的異常的表觀遺傳修飾和染色質開放性可能會改變端粒酶對端粒的調控而影響端粒長度［63］。lncRNA在細胞分化和生物體發育過程中發揮關鍵功能，已經證明卵母細胞的lncRNA在核重編程和早期胚胎發育中具有關鍵作用，尤其是染色體重塑的過程中。胚胎在不同的發育階段也會受到不同lncRNA的調控，即lncRNA的調控具有階段特異性［64-65］。而Wu等［66］研究則表明階段特異性的lncRNA未在SCNT胚胎中正確表達，并且卵母細胞來源的lncRNA也未在ZGA后降解。lncRNA的正常降解和轉錄過程可能在SCNT胚胎中受到抑制，從而導致了胚胎的發育阻滯。上文提及的ERV是在表觀遺傳修飾重編程期間重新連接基因表達網絡的多功能參與者，在ZGA時轉錄激活，然后通過DNA甲基化，組蛋白修飾，轉錄后沉默等機制抑制。因此，研究ERV活化可以為研究ZGA過程的分子機制和提高SCNT胚胎的發育潛力提供新的思路［67］。

4 展望

在SCNT中，供體細胞核的重編程存在諸多障礙，尤其是表觀遺傳修飾的重編程。如何研究并展現SCNT胚胎的重編程過程，了解其與受精胚胎發育的差異，并且糾正這種差異是今后SCNT研究亟需解決的問題。隨著組學技術的廣泛應用，胚胎發育過程中的轉錄組、表觀遺傳組的變化得以呈現。尤其是近十年來，基于微量樣品的測序技術開始應用于發育生物學的研究，如單細胞轉錄組測序、單細胞甲基化測序。這些技術共同描繪出受精胚胎和SCNT胚胎發育重編程過程中的轉錄組及表觀修飾組的動態圖譜，對了解SCNT胚胎發育的屏障有著重要的意義。正常受精胚胎從原始生殖細胞的生成便已經開始為重編程做準備，而SCNT胚胎的正常發育只能依靠供體細胞核的重編程，最終只有少數胚胎能夠正確完成重編程并順利發育。近期的一項研究建立了一種稱為“Waddington-OT”的方法，這種方法能夠推斷祖先后裔的命運，并對其可能的調控機制進行建模。同時該研究還預測并證實了能夠提高細胞重編程效率的轉錄因子Obox6和細胞因子GDF9［68］。Waddington-OT方法及其他推演細胞發展軌跡的研究將使了解胚胎重編程中的細胞命運并加以調控成為可能，如何運用這類方法來提高SCNT的效率將會成為未來研究的一個重要方向。