牛超數排卵技術研究進展

王洋洋 隋鶴鳴，2 趙善江 許慧韜 郝海生 龐云渭 趙學明朱化彬

（1. 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193；2. 吉林大學動物醫學院，長春 130062）

家畜胚胎移植技術（Embryo transfer，ET），尤其是牛胚胎移植技術經過幾十年的研究日趨成熟，并在生產中得到了廣泛應用，成為家畜育種和快速擴繁的重要技術手段［1-4］。

目前，供體母牛超數排卵（簡稱超排）后第7天非手術采集獲得的胚胎仍然是移植所需胚胎的重要來源［5］。雖然眾多研究人員曾對牛超排方法及其影響因素展開深入研究，并取得了較大進展［6-7］，但是牛胚胎移植成功近70年來，供體牛每次超排獲得的平均可用胚胎數幾乎沒有增加［8］，而且約有1/3的供體母牛對超排反應較差［9-10］，約64%的供體牛生產的可移植胚胎數低于平均值［11］，甚至有15%左右的供體牛不能提供可移植胚胎［12-13］。超排反應的不確定性增加了牛體內胚胎的生產成本，限制了牛胚胎移植技術在生產中進一步的廣泛應用［14-16］。

因此，近年來為了提高超排效果，降低牛體內胚胎生產成本，許多研究者開展了牛超排處理程序與影響因素的研究，并取得了較好的進展。本文簡介了牛超排方法與主要影響因素，重點綜述了牛超排最新研究進展，以期為牛超排效果的改善和胚胎移植效率的提高提供參考。

1 牛超數排卵及其影響因素

1.1 牛超數排卵

超數排卵是在母牛發情周期的一定時間給予外源促性腺激素如促卵泡素（Follicle stimulating hormone，FSH）處理，從而使供體母牛卵巢上有多枚卵泡能夠發育成熟并排卵，在人工授精后一定時間內通過非手術采集而獲得多枚胚胎的技術［17-19］。雖然初情期后母牛卵巢上腔前卵泡的生長不需要促性腺激素的支持，在卵巢旁分泌和自分泌作用的調控下即可由靜止原始卵泡庫自發進入生長卵泡庫，但是當卵泡發育至有腔卵泡階段及其隨后的發育進程則依賴于血液中足夠的促性腺激素（FSH和LH）的支持［20-23］，缺少FSH的支持，卵泡就無法繼續發育而發生閉鎖退化。因此，如果在適宜的發情狀態下對母牛注射外源FSH，以彌補牛外周血中因FSH濃度下降導致的內源性FSH不足，就可使母牛卵巢上多枚有腔卵泡都能得到充分的FSH的支持，從而得以繼續生長發育、形成優勢卵泡并排卵［24］，從而起到超數排卵的作用。

牛超數排卵成功的前提是：（1）外源FSH可支持供體牛卵巢上多枚卵泡發育、成熟并排卵；（2）外源FSH處理不影響卵母細胞質量以及發育和受精能力；（3）外源FSH處理不降低供體牛生殖道的機能，特別是輸卵管支持卵母細胞受精、早期胚胎發育和運行胚胎的能力。

超排期間供體牛血液中FSH必須維持一定的濃度才能保證超排效果。因此，利用外源FSH超排處理供體牛時，根據其半衰期長短而采取不同的給藥方式是維持供體牛血液中外源FSH濃度的保障。馬絨毛膜促性腺激素（Equine chorionic gonadotrophin，eCG），過去亦稱孕馬血清促性腺激素（Pregnant mare serum gonadotrophin，PMSG），是最早用于牛超數排卵的促性腺激素之一。20世紀中期許多研究者，特別是美國的哈弗士和艾弗里等詳細地研究了eCG處理對供體牛發育卵泡數量、卵泡排卵和卵母細胞受精、胚胎質量的影響，建立了eCG超排供體牛的基本方法，并取得了較好的超排效果［19，25-27］。由于eCG半衰期較長，因而用eCG對供體牛超排時只需要一次注射就能起到超排的作用［28］，但是用eCG超排的方案存在如下問題：一是由于eCG同時具有FSH和LH的活性，導致供體牛對eCG超排處理的反應差異大，效果不穩定；二是由于eCG半衰期長（40 h左右），在注射后的較長時間內可對卵巢造成持續性刺激，從而容易造成大卵泡不排卵或未排卵卵泡黃體化；三是造成供體牛生殖內分泌紊亂，雌激素分泌過多，形成不利于早期胚胎發育的生殖道內環境；四是長時間的促性腺激素刺激可促使卵母細胞提前成熟，從而影響卵母細胞受精或受精卵發育［29］。

相比之下，FSH對牛的作用效果更加溫和，FSH也成為超排時使用最為普遍的促性腺激素。由于FSH含糖量較低，其在供體牛體內的半衰期只有5 h左右［30］。因此，超排時需要每天2次連續4 d注射FSH，才能保證供體牛血液中維持超排所需的FSH濃度，研究表明此方案可獲得較好的超排效果［10，31-33］。目前，全世界廣泛使用的FSH超排供體牛的方法是連續4 d每天2次遞減注射FSH法［27］，可分為兩種基本的處理程序：方法1，在供體牛自然發情或前列腺素（Prostaglandin，PG）同期處理發情后一定時間內（發情后8-13 d）任意一天開始注射FSH，上下午各注射1次，連續注射4 d，第3天上下午注射FSH同時注射PG，第5天上午（早晨）觀察供體牛發情，第5天晚上人工授精（Artificial insemination，AI）配種，間隔12 h第2次配種，第12天上午采集胚胎；方法2是在供體牛發情周期的任意一天埋植孕酮制劑（Controlledinternaldrug release，CIDR），埋植后第5-7天的任意一天開始上午、下午各注射1次FSH并在第7天撤栓，其余處理與方法1相同。

1.2 影響牛超數排卵效果的因素

雖然影響牛超排效果的因素眾多而復雜，但可分為供體牛自身因素和外部因素。供體牛自身因素主要包括超排時牛年齡與胎次、生產性能、發情狀態和卵巢機能［34-36］、體況和疾病等［37-38］；外部因素主要包括供體牛飼料營養與飼養方式［39-41］、激素種類與來源和注射方法與劑量［42-43］、溫度與季節、超排處理程序、采卵方法和沖卵操作人員技術水平等［44-47］。

雖然許多研究人員試圖尋找供體牛對外源FSH超排處理反應差異的分子基礎，但是超排效果與供體牛遺傳基礎（基因型）的相關性較低，重復力也較低［48-49］，因此，目前試圖通過遺傳因素選擇超排效果好的供體牛還存在巨大困難。

2 超數排卵研究最新進展

連續4 d共8次注射外源FSH超排供體牛的方法可取得較好的超排效果，但是這種超排處理程序也存在下列問題：（1）工作量大；（2）供體牛應激大，影響超排效果；（3）供體牛需要相對集中飼養。因此，簡化超排處理程序對提高供體牛超排效果和降低胚胎生產成本具有重要的實際意義［50］。近20年來，為提高牛的超排效率，許多研究者針對牛超排方案的改進進行研究，并取得了一定進展［51-52］。

2.1 FSH一次注射法

雖然很早就有研究者試圖對牛進行FSH一次注射以簡化超排程序，但是取得的效果并不理想［53］。后來有研究者將FSH皮下一次性注射到體況良好的肉牛供體獲得了較好的超排效果［54］，但是皮下一次注射FSH方法對體況較差的肉牛和荷斯坦牛的超排效果較差［50，53，55］，改為肌肉一次注射也不能達到預期的超排效果［50］，這可能是因為體況較差肉牛和荷斯坦供體牛注射部位脂肪組織較少，皮下一次性注射可能將FSH注射到肌肉中，不能有效保證FSH被緩慢吸收進入血液，從而影響超排效果。如果選擇短針頭（～12 mm）或者皮下脂肪較多部位（如肩部）注射FSH，即可避免將FSH注射到肌肉中，并且可取得較好的超排效果［50，55］。

有試驗研究了兩次注射FSH超排荷斯坦供體牛的方法，即第一天注射總劑量75%的FSH，48 h后注射剩余25%劑量的FSH，超排效果優于一次注射FSH，但是不如4 d共8次FSH注射法［55］。

如果將FSH溶解在某些物質溶液——緩釋劑中，在注射供體牛后FSH可緩慢釋放，就可以在更長時間內使供體牛血液中FSH維持在一定的濃度，從而達到超排的作用。作為FSH的緩釋劑必須具備以下特性：（1）機體內可降解；（2）在機體組織不發生反應；（3）使用方便。目前，牛超排常用的FSH緩釋劑包括氫氧化鋁凝膠溶液（Al-gel）、透明質酸溶液（Hyaluronan，HA）和聚乙烯吡咯烷酮溶液（Polyvinylpyrrolidone，PVP）等。

研究表明，將一定劑量的FSH溶解在30%的PVP溶液中超排日本黑牛、荷斯坦奶牛和泰國本地牛，都取得了與4 d共8次注射FSH超排方法相似的效果［56-58］。

Kimura等［59］研究了氫氧化鋁凝膠（Al-gel）作為FSH緩釋劑對供體牛進行一次注射的超排方法。試驗結果表明，30 mg FSH溶解在Al-gel中一次注射超排日本黑牛，與對照組4 d共8次注射超排供體牛的效果類似，表明氫氧化鋁凝膠可作為FSH佐劑超排供體牛。Al-gel是許多疫苗的佐劑［60-61］，多應用于注射類藥物中。但肌肉注射Al-gel易引起注射部位的組織硬化，限制了其在牛超排工作中的應用。

目前使用較多的FSH緩釋劑是透明質酸。透明質酸是一類生物大分子聚合物，含有2000-2500個重復單位的D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺雙糖多聚合物，廣泛存在于動物機體內如家畜生殖道中，其在動物組織內可生物降解，不參加生物反應［62］，HA分子在水溶液中呈三維網狀結構，其水溶液具有一定的黏度，是FSH和其它藥物的良好佐劑［63-64］。

有試驗以透明質酸溶液溶解的FSH對供體牛進行超排處理。結果表明，用2%的透明質酸溶液溶解的FSH對牛進行一次性肌肉注射處理所得胚胎總數和可用胚胎數與4 d共8次注射超排方法相似。用1%的透明質酸溶液溶解的FSH對牛進行皮下一次性注射處理，發現FSH吸收較快，外周血液中不能持續維持超排需要的FSH濃度，從而使很多卵泡不能發育到排卵階段，僅在處理開始時發育狀態良好，在后期便閉鎖退化［65-67］。Tribulo等［68］研究了以西門塔爾牛、婆羅格斯牛和安格斯雜交牛為供體牛，用1%的HA溶解的FSH對其進行間隔48 h兩次注射的超排方案，即第一次注射總劑量的67%，48 h后注射其余的33%。結果表明該法獲得了與常規超排方法相一致的結果［69-70］。而Palomino等［71］將FSH溶解在0.5%的HA溶液中分3次間隔36 h注射超排美洲森林野牛也取得了較好的超排效果。

雖然2%的HA溶解的FSH超排效果較好，但是FSH較難溶解在2%的HA中，這給超排時現場溶解FSH的操作帶來不便。相比之下，FSH更容易溶解在1%或0.5%的HA中。以1%或0.5%的HA溶解的FSH，兩次注射（間隔48 h）或者3次注射（間隔36 h）對牛超排處理，既減少了FSH的注射次數，又保證了供體牛的超排效果，是較理想的FSH緩釋超排方案［72］。另外，不同濃度HA緩釋的FSH 1次注射超排肉牛能取得較好的結果，但是同樣方法對泌乳荷斯坦牛的超排效果并不理想。這可能是因為泌乳母牛代謝旺盛，血液流經肝臟的速度快，因而FSH代謝也較快［72］，需要適當增加FSH的注射次數才可能保證超排效果，但還需要進一步試驗驗證。

2.2 重組長效FSH

由于垂體提取的天然FSH分子中所含糖基鏈較短，因而FSH在體內的半衰期較短。通過基因重組技術，設計改造FSH結構，增加FSH分子的糖基長度以生產長效重組FSH（rFSH），延長其在動物機體內半衰期，則在家畜繁殖和人類輔助生殖中具有廣闊的應用前景［73-75］。與用常規FSH的超排方案相比，用長效重組FSH制劑超排供體牛時可減少注射次數，節省人力和減少供體牛應激，因而很早就有人利用重組牛源FSH（rbFSH）對牛進行超排處理，并獲得較好的超排效果。Carvalho等［76］研究了重組FSH超排12-15月齡的荷斯坦供體牛，結果表明，一次性注射長效rbFSH對供體牛超排的效果與4 d共8次注射FSH的超排結果相似，且高劑量注射rbFSH的牛超排效果更好，但不同類型的rbFSH制劑的超排效果差別很大［73］。因此，體外重組長效FSH在應用前，還需要深入研究：（1）不同類型重組FSH的超排方案；（2）重組FSH的適宜注射劑量；（3）重組FSH在母牛體內的代謝規律。

2.3 供體牛選擇

2.3.1 AMH與供體選擇 超排前能夠選擇超排效果好的供體牛，則可有效提高胚胎生產效率和降低胚胎生產成本。雖然目前還未發現供體牛對外源FSH反應差異的有效遺傳標記，但有些激素如抗繆勒管激素（Anti-müllerian hormone，AMH）與供牛超排效果具有一定的相關性。AMH是由雄性動物睪丸支持細胞和雌性動物卵泡顆粒細胞分泌的糖蛋白質激素，屬于轉化生長因子β家族［77-78］。初情期后母畜卵巢中發育的原始卵泡和早期有腔卵泡顆粒細胞分泌AMH，而閉鎖卵泡和優勢卵泡AMH含量則很低。因此，外周血中AMH的濃度，反映了家畜卵巢活性、發育卵泡數量和卵泡質量等狀況［79-82］，可作為母牛有腔卵泡庫、繁殖性能和胚胎生產的內分泌標記［83-86］。

AMH可作為選擇荷斯坦供體牛的生物標記。Rico等詳細研究了母牛血液中AMH濃度與超排效果之間的關系發現，AMH濃度與超排時供體牛卵巢直徑3-7 mm大小的卵泡數量呈正相關，而這些卵泡正是超排時對外源FSH敏感、能夠發育成熟并排卵的卵泡，隨后他們還發現經FSH處理的牛在發情時，其血液中AMH濃度低的供體牛卵巢上大卵泡數量就少；并且采集胚胎時血液中AMH濃度低的供體牛，采集獲得的胚胎和受精卵也很少［87-88］。Verstegen等［81］也發現，母牛在2月齡左右時其外周血AMH濃度達峰值，此后隨著牛的老化才開始下降，AMH濃度平均可保持4月左右的穩定值，外周血AMH濃度高的牛超排獲得的胚胎數更多。Souza等［88］發現供體牛在發情周期的不同時間點其血液中AHM含量相差不大，隨著AMH濃度的升高，供體牛黃體數、獲得卵數/胚胎和可用胚胎數均增加。高濃度AMH組的供體牛黃體數和獲得胚胎總數是低濃度AMH組牛的2倍，但AMH與卵母細胞的受精率沒有相關性。Monniaux等［85］研究也發現，供體母牛血液AMH濃度高的供體母牛頭均獲得胚胎數和可用胚胎數高于AMH濃度低的供體牛。畢江華等［89］分析了重復超排的荷斯坦供體牛血液中AMH濃度與超排效果之間的關系，結果發現在胚胎采集時，血液AMH濃度高的供體牛其超排效果優于AMH濃度低的牛。但該研究試驗牛只數量較少，時間跨度較大，具體效果仍需進一步試驗驗證。

AMH也可作為選擇肉牛供體的生物標記。Hirayama等［90］詳細研究了不同月齡的日本黑牛血液中AMH的變化及其與牛超排效果的關系。結果發現，青年牛10或11月齡前后血液AMH濃度與13-18月齡時的超排效果呈正相關，因此認為11月齡青年牛血液中AMH可作為供體牛早期選擇的生物標記，但是經3次超排后的供體牛血液中AMH濃度顯著降低，其與超排效果的相關性也降低［90］。Nabenishi等［91］研究也發現，日本黑牛供體血液中AMH濃度相對穩定，在人工授精時AMH濃度高的牛超排所得胚胎總數、可移植胚胎數皆更多。

2.3.2 重復超排與供體選擇 雖然超排效果與供體牛的遺傳相關性不大，但是超排反應良好的供體牛，再次超排時效果往往也較好，因而也可以作為供體選擇的依據［48］。Ireland等［92］研究表明，超排時卵巢上發育卵泡數量多的供體母牛超排效果好于卵泡數少的供體，并具有很高的重復性。

2.4 吸除優勢卵泡

雖然超排時供體牛卵巢上眾多的有腔卵泡是超排效果的保證［90，92］，然而因優勢大卵泡可抑制早期有腔卵泡的生長發育，促進直徑6 mm以下卵泡的閉鎖［93］，所以超排處理開始時，如果母牛卵巢上存在優勢卵泡會降低供體牛的超排效果［92，94］。因此，超排時通過超聲波檢查卵巢上優勢卵泡的存在并吸除優勢卵泡，就可解除優勢卵泡對其他有腔卵泡發育的抑制作用，并開始新的卵泡發育波，從而可提高超排效果［95-97］。

但是，吸除優勢卵泡需要特殊設備——B超儀和吸卵設備，以及操作熟練的技術人員，因而在實際生產現場的廣泛應用存在一定的困難。

3 趨勢與發展

供體牛超數排卵效果不穩定性和不可有效預測性仍然是影響牛體內胚胎生產的重要因素，因此，未來仍然需要在以下幾個方面繼續研究和完善：（1）建立選擇供體牛的有效方法。目前AMH可作為供體母牛選擇的生物標記，但是還需要建立快速定量測定AMH的有效方法，包括統一度量衡單位。同時，還應繼續尋找可預測牛超排效果的遺傳標記和生物標記；（2）優化超排程序。雖然傳統的4 d共8次注射FSH方法的超排效果較穩定，但是費時費力，效率也并未提高。研究建立利用重組FSH超排供體牛的方法并降低其成本可能是優化供體牛超排方法的有效途徑；（3）解析營養與環境因素對牛超排效果的影響及其機制。營養和環境（包括疾?。w牛繁殖機能的影響是不言而喻的，但是營養和環境對超排牛卵泡發育與排卵、胚胎發育與質量等的具體影響及其機制還有待深入研究。