內向整流鉀通道對少突膠質前體細胞發育的作用

海霞霞，朱娜，王俊燕，肖晶晶，畢逢辰，鄭曉敏，李云鴻，王銀

（寧夏顱腦疾病重點實驗室，寧夏醫科大學基礎醫學院，寧夏 銀川 750004）

少突膠質細胞（oligodendrocyte，OL）是中樞神經系統中的髓鞘形成細胞，其發育異常與中樞神經系統多種疾病的形成有關[1]。研究[2，3]發現多種因子可以促進或抑制少突膠質細胞的分化，包括轉錄因子和神經元旁分泌因子等。內向整流鉀離子通道Kir4.1在中樞神經系統中發揮著很多重要的作用，但是其在少突膠質前體細胞（OPC）的發育過程中是否發揮作用還是未知。有研究[4]表明，多發硬化癥的病人在炎癥狀態下，Kir4.1通道的蛋白表達大量增加，產生Kir4.1通道的自身抗體。這提示在髓鞘相關疾病當中，Kir4.1通道可能參與其中并發揮某種作用。本文擬研究Kir4.1通道對OPC增殖和分化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠購自寧夏醫科大學實驗動物中心；DMEM培養基購自Hyclone公司；胎牛血清購自Gibico公司；蛋白定量BCA試劑盒和Mouse抗HRP標記二抗購自Pierce公司；desipramine購自Tocris公司；MBP抗體購自Millipore公司；PCR引物由生工公司合成；GAPDH抗體購自Cell Signaling公司；Ki67抗體購自Abcam公司。

1.2 方法 （1）大鼠少突膠質前體細胞原代培養：剪下出生后3 d SD大鼠的頭部，取出大腦，顯微鏡下去除其海馬和血管膜留下大腦皮層；37oC胰酶消化20 min，打散細胞，培養在多聚賴氨酸鋪的培養瓶；每3天換一次培養液；第7 d時，分別以200 r/min和1，100 r/min的轉速37oC搖細胞1 h和16 h去除小膠質細胞和星形膠質細胞；將上清離心，沉淀便是少突膠質前體細胞，培養在多聚賴氨酸培養皿中。（2）利用Western blot檢測Kir4.1和MBP表達：抑制劑Des處理前后，提取各組細胞的蛋白并收集上清液，BCA法進行蛋白定量。利用10% SDS-PAGE分離蛋白后轉至PVDF膜，用脫脂牛奶在搖床上封閉膜2 h。加入一抗，4oC過夜。利用TBST充分洗滌膜后，用二抗室溫孵育1 h，ECL試劑顯色成像。（3）利用PCR檢測Kir4.1和MBP mRNA水平：提取總RNA，反轉錄為cDNA，利用PCR試劑盒，依據操作步驟，進行PCR反應，1%瓊脂糖凝膠鑒定。

1.3 統計學分析 采用SPSS 11.9進行統計學分析。實驗數據用均數±標準差（Mean±SD）表示，組間比較用方差分析，進一步比較兩兩間差異采用Student-Neuman-Keuls Test方法。

2 結果

2.1 Kir4.1和MBP在OL細胞中表達升高 PCR和Western blot結果表明，OPC中和OL中都有Kir4.1基因和蛋白表達，但在OL中表達更高。MBP只在OL中表達，因為MBP是成熟的OL的標志。

2.2 阻斷Kir4.1可以抑制OPC向OL細胞分化 Western blot結果顯示，利用desipramine阻斷Kir4.1后，MBP的表達顯著減少，說明阻斷Kir4.1抑制了OPC向OL細胞分化。

2.3 阻斷Kir4.1可以促進OPC的增殖 抑制劑處理后，對細胞增殖因子ki67的檢測結果顯示，其表達增加，顯示阻斷Kir4.1促進了OPC的增殖。

3 討論

少突膠質細胞發育異常會導致髓鞘形成障礙，形成多種中樞神經系統脫髓鞘相關疾病，比如多發硬化癥、視神經炎等，給社會和患者家庭都帶來了沉重的負擔[5]。本課題的研究意義在于對中樞神經系統髓鞘相關疾病的機制進行探索，為治療中樞神經系統髓鞘相關疾病提供一些理論基礎。OPC向OL的正常分化是CNS髓鞘正常形成的必要條件。但是目前雖然對OPC分化機制的研究已經取得了一些進展，但其具體機制尚不十分清楚。

有研究[6]報道，在多發硬化癥病人的OL上內向整流鉀通道Kir4.1的免疫活性降低，但是Kir4.1對OPC發育的影響還不清楚。因此我們研究了Kir4.1對OPC發育的影響。

我們的實驗結果顯示Kir4.1在OPC和OPC中都有表達，但是OL中更高。阻斷Kir4.1，促進了OPC的增殖，但是抑制了OPC的分化，其機制還有待于進一步研究。但是Kir4.1或許可作為髓鞘相關疾病的一個新靶點。