二型脫碘酶泛素化修飾及其基因多態性與甲狀腺疾病

孫瑩 姜雅秋

中國醫科大學附屬第一醫院內分泌與代謝病科，中國醫科大學內分泌研究所，遼寧省內分泌疾病重點實驗室，沈陽 110001

脫碘酶是含硒蛋白酶，包括一型脫碘酶(D1)、二型脫碘酶(D2)和三型脫碘酶(D3)，它們在甲狀腺激素代謝過程中起重要調節作用。甲狀腺激素的生物活性主要是由D2來調控的，D2的外環脫碘作用主要是通過泛素化來完成，泛素化是蛋白質的一種降解途徑。D2泛素化與甲狀腺激素的敏感性有關。因此，其對甲狀腺功能減退癥的治療效果也有一定的影響。D2基因多態性也參與甲狀腺激素的轉換和代謝，可能會影響甲狀腺激素水平。因此，D2在甲狀腺疾病中扮演著重要的角色，現就D2泛素化特點、基因多態性及其與甲狀腺疾病的研究進展予以綜述。

1 泛素-蛋白酶體通路

泛素-蛋白酶體系統(UPS)是真核細胞中短壽命蛋白質的主要降解途徑。UPS在細胞進程包括細胞周期進展、基因表達、蛋白質抑制等方面調節蛋白質的表達。泛素化過程消耗ATP，能高效、高選擇的降解蛋白質。泛素化過程通常需要3種泛素化酶的協同作用: 泛素激活酶(E1)、泛素耦聯酶(E2)和泛素連接酶(E3)[1-2]。

2 D2及其UPS

D2是碘甲狀腺素脫碘酶家族中的一員，為含硒蛋白酶。D2催化外環碘的脫碘作用，使T4轉化為活性更強的T3，影響局部T3的可用性[3-4]。D2催化的T3產生發生在細胞內，可增加甲狀腺激素信號，而D2活性降低或影響D2基因表達會影響機體甲狀腺功能。D2的表達受不同的發育狀態、代謝或環境[如hedgehog途徑、腎上腺素能和G蛋白耦聯膽汁酸受體1(TGR5)激活的cAMP途徑]、黃酮醇等異種生物分子和內質網應激的調控，這些信號通過真核生物翻譯起始因子2α(EIF2α)介導起作用。嚙齒類動物適應性產熱的主要部位是棕色脂肪組織，棕色脂肪組織產熱需要解耦聯蛋白1(UCP1)的表達，UCP1受T3的調節，D2活性對于T4到T3的局部轉化是必不可少的。研究發現，D2基因敲除小鼠體溫過低，必須依靠顫抖來維持體溫[4]。

D2主要分布于中樞神經系統，其在正中隆起-弓狀核區的活性最高。下丘腦D2主要在伸長細胞中表達。腦組織中的T4在D2催化下轉化為活性更強的T3。研究表明，腦內超過75%的T3是由D2介導的T4外環脫碘作用轉化而來[4]。D2缺乏時，盡管循環中T3水平正常，但下丘腦中T3含量減少[5]。因此，在下丘腦中發揮作用的T3部分是從局部T4通過脫碘轉化而來的。

泛素化和UPS對于體內蛋白質穩態至關重要。除了溶酶體途徑外，細胞也通過泛素化標記并被蛋白酶體吸收來處理不需要的蛋白質。泛素化是可逆的、循環的、多種酶參與的過程，該過程為3種酶介導的級聯反應：通過E1激活泛素分子，該過程為ATP依賴反應；活化的泛素轉移到E2；通過含E2和(或)E3的復合物將目標蛋白內的賴氨酸殘基多聚泛素化。

D2泛素化具有組織特異性，用L-T4治療的甲狀腺切除大鼠T4向T3的轉化率更高，全身組織依賴D2的T3產生減少，但是下丘腦T4向T3的轉化受影響最小[6]。特異性敲除星形膠質細胞WSB-1，觀察到與其他組織相比，下丘腦D2泛素化效率更低[7-8]。

3 D2泛素化過程相關酶

泛素化過程的底物通過靶蛋白與E3家族相互作用。人類基因組編碼超過600種不同的E3，負責從原核生物到真核生物的大量底物的泛素化。大部分存在于內質網膜上，介導胞質或膜結合底物的泛素化[9]。

D2的泛素化使得D2的二聚體結構發生構象變化而失活。近年來研究發現，D2泛素化的過程即形成K48-連接的泛素鏈，涉及兩種E3：WSB-1(WD repeat and SOCS box-containing protein 1, WSB-1)和TEB-4[membrane associated ring finger(C3HC4) 6，MARCH 6或TEB-4][10]。泛素化的D2在p97-ATPase的介導下逆向轉運到胞質中，送入蛋白酶體中被降解[11]。同時該過程還有兩種去泛素化酶的參與：泛素特異蛋白酶(USP)20和USP33。

4 D2與下丘腦-垂體-甲狀腺軸

促甲狀腺激素釋放激素(TRH)由下丘腦室旁核神經元產生，調節垂體促甲狀腺激素(TSH)細胞的經常性活動。存儲于下丘腦的TRH經垂體門脈系統作用于TSH細胞，一是促進TSH釋放，二是激活靶基因促進TSH合成。TSH分泌增加可促進甲狀腺激素的合成和分泌，使循環血液中甲狀腺激素水平升高，形成一個負反饋，抑制TRH和TSH的分泌[12]。由于T4的活性很低，D2在調節這個循環中扮演著重要的角色，它促進血漿T4轉化為具有生物活性的T3，并使垂體TSH正常表達[9]?？剐穆墒СＫ幬锇返馔獙谞钕俟δ苡兄匾绊?，主要表現在使TSH水平升高，用胺碘酮處理D2基因敲除小鼠(D2KO)，只有野生型(WT)對照組的血漿TSH水平出現了預期約2倍的升高，說明D2在這一機制中發揮了關鍵的作用。胺碘酮對D2信號通路的破壞可能會干擾T4信號的轉導，使T3產生減少，減弱TSH的反饋機制。研究還發現，胺碘酮治療的患者和實驗動物血清T4和TSH水平往往會短暫升高，持續數月，T4通過垂體和下丘腦抑制D2活性，在負反饋環中發揮作用，分別減少TSH和TRH的產生，這種表型類似于D2KO小鼠。因此，胺碘酮所致TSH水平升高依賴于D2的功能，很可能源于D2在垂體水平受到的抑制[9]。D2在調節TRH的作用中也扮演著相似的角色。研究表明，D2誘導產生的T3通過旁分泌機制負反饋調節室旁核TRH神經元。

5 D2的泛素化修飾與甲狀腺疾病

臨床研究表明，5%～10%用L-T4治療的甲狀腺功能減退癥患者血清TSH水平正常但仍有持續的癥狀[13]?；颊哂肔-T4治療后，血清T4/T3的比值相對更高，這一比例的長期升高對甲狀腺激素信號轉導和機體健康是否有影響還是未知?；谶@種殘余甲狀腺功能減退癥狀的分子基礎的缺乏，研究者構建了甲狀腺功能減退癥大鼠模型，分別給予L-T4、L-T3和L-T4+L-T3干預，檢測不同組織D2泛素化差異及甲狀腺激素信號轉導水平，研究發現，單純的L-T4治療導致血清T3水平相對降低和T4/T3比值相對升高，在垂體和其余的腦組織中，大部分T3主要是由T4通過D2脫碘作用產生。該通路受D2泛素化程度限制，由于T4可降低D2活性，對棕色脂肪組織、下丘腦、垂體、小腦、皮質、海馬等表達D2的組織的研究顯示，不同組織D2的泛素化程度存在差異，下丘腦D2的活性受T4的影響最小[6]。通過構建星形膠質細胞泛素化連接酶WSB-1基因敲除小鼠發現，在大腦皮層和海馬，WSB-1介導T4誘導的D2失活，在小腦WSB-1不介導T4誘導的D2失活，而在下丘腦，T4對D2的調節作用是最小的。D2在調節局部T3的含量中起重要作用。D2半衰期取決于T4的水平[14]。當有T4存在時，其半衰期大約20 min，當T4缺乏時，其半衰期被延長到幾小時。當血清T4水平較低或碘缺乏或甲狀腺功能減退時，D2在細胞中積累會增加T4向T3的轉化。相反，由于T4能夠使D2失活，所以當T4水平升高時，甲狀腺激素信號轉導可能會減弱。即在有D2表達的組織中，用L-T4治療的患者血清T4/T3比值升高會減弱甲狀腺激素的信號轉導。

D2在正常甲狀腺中表達，可能是甲狀腺濾泡細胞分化的標志物。既往的研究已經證實，D2在甲狀腺乳頭狀癌中呈低表達。早期研究表明，甲狀腺中的D2來源于濾泡而不是濾泡旁C細胞，研究發現，D2在甲狀腺髓樣癌(MCT)中高表達，MCT是一種起源于C細胞的腫瘤。該研究選取12例MCT患者術后髓樣癌組織，在12例樣本中均檢測到D2轉錄本，D2活性與正常濾泡組織中相似。對人MCT細胞系TT細胞的進一步研究表明，D2的表達受甲狀腺激素的調節而下降，在MCT髓樣癌組織樣本中也發現甲狀腺激素受體α1和β亞基，提示D2在腫瘤組織局部使T4轉化為T3并發揮作用[15]。

本課題組大型流行病學調查結果顯示，人群中TSH水平隨著碘攝入量增加而上升[16]?；谶@一結果所做的基礎研究顯示，D2泛素化在慢性碘過量所致的TSH水平升高中起重要作用，慢性碘過量大鼠垂體D2泛素化增強，D2活性下降[17]。

另外，D2單核苷酸多態性Thr92Ala(rs225014)參與甲狀腺激素的轉換和代謝，可能影響甲狀腺激素水平。研究發現，不是所有患者接受L-T4治療都具有將T4轉化為T3的能力[18]。Torlontano等[13]研究表明，191例分化型甲狀腺癌患者接受甲狀腺全切及放射性碘治療，D2的Thr92Ala多態性與L-T4的劑量有關。純合子Ala/Ala攜帶者需要L-T4的水平比非攜帶者高20%左右。然而，Heemstra等[19]的研究沒有證實這些結果，D2的Thr92Ala多態性與L-T4劑量無關。也沒有觀察到4種D2基因多態性 (rs225011、rs7140952、rs225012、rs2839858)與患者L-T4劑量有關[20]。

綜上所述，D2控制著細胞特異性甲狀腺激素的激活，D2泛素化在維持體內甲狀腺激素平衡、發育和代謝中起重要作用。D2在下丘腦、垂體及其他組織中作用及其機制仍有待進一步研究。D2基因多態性影響著L-T4治療甲狀腺疾病的效果，其機制需進一步研究。