外泌體與妊娠糖尿病

王香青 馬振軍 孔方方

中國人民解放軍464醫院婦產科，天津 300381

妊娠糖尿病在全球范圍內影響著近15%的孕婦，其發病率隨著肥胖與2型糖尿病發生幾率的增加而提高[1]。根據國際糖尿病與妊娠研究組標準，全球范圍內妊娠糖尿病的發病率接近18%[2]。盡管妊娠糖尿病患者的葡萄糖耐量在產后可以恢復正常，但是妊娠糖尿病極大增加了其將來發生糖尿病的風險。研究發現，妊娠糖尿病母親所生女嬰將來更容易發生妊娠糖尿病[3]。因此，了解妊娠糖尿病發生的病理生理學機制，選擇合適的治療方案，以獲得良好的妊娠結局非常重要。外泌體是納米大小的顆粒，直徑為50～120 nm，參與細胞間的信息傳遞，包括生物活性分子如蛋白質、脂質、RNA的轉運[4-7]。研究顯示，外泌體通過激活自身免疫、增加β細胞凋亡、調節細胞因子等，參與糖尿病的發生[8]。而最新的研究發現，妊娠時血漿外泌體水平顯著升高，胎盤細胞來源的外泌體在調節母體和(或)胎兒血管的反應中發揮作用，外泌體水平的改變可能用于診斷胎盤的功能異常[9]。另外，妊娠糖尿病患者血漿外泌體水平也顯著升高[10]。因此，外泌體可能也參與了妊娠糖尿病的病理生理學機制。

1 外泌體概述

細胞外囊泡是膜來源的顆粒，在細胞間信息傳遞中發揮關鍵作用，負責從近端向遠端傳遞分子信號[11]。細胞外囊泡是由一系列不同的顆粒組成，根據來源、形態及釋放到細胞外的模式，主要分為3個顆粒群，即凋亡體、微粒體及外泌體。凋亡體的直徑為0.8～5 μm，參與細胞的程序性死亡。微粒體又稱為核外顆粒體，直徑為0.1～0.35 μm，來源于血漿質膜外出芽[12]。外泌體是被稱為多泡小體的特定內涵體與質膜融合后分泌到細胞外環境的囊泡，在許多生物學過程中介導細胞與細胞間的信息交流[13]。

外泌體就像細胞的指紋，能夠反映其來源細胞的表型。它們的關鍵作用是協調與調節受體細胞的分子信號通路，在疾病的發病機制中發揮作用。人體所有細胞包括脂肪組織、肝臟、胰腺、骨骼肌及妊娠時期的胎盤，都可以分泌外泌體。與正常飲食喂養的小鼠相比，富含棕櫚油飲食喂養的小鼠骨骼肌細胞分泌更多的外泌體，用富含棕櫚油的脂肪酸預處理C2C12肌細胞，也可以促進C2C12肌細胞分泌外泌體。將從脂肪酸預處理的C2C12肌細胞分離得到的外泌體與分化的C2C12肌細胞共孵育，可以誘導肌細胞內某些基因與蛋白表達的改變，表明外泌體可以將脂肪酸的作用傳遞給肌細胞，從而破壞肌細胞穩態，參與脂質誘導的胰島素抵抗的發生[14]。對胰腺癌來源的外泌體進行研究，發現其可進入C2C12骨骼肌細胞，促進脂質沉積，抑制葡萄糖攝入。同時，外泌體可以下調胰島素及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B/FoxO1信號通路，降低下游葡萄糖轉運蛋白4的活性[15]。從高脂飲食喂養小鼠骨骼肌細胞分離得到的外泌體可以被MIN6B1細胞攝取。進一步研究發現，外泌體攜帶的微小RNA(miRNA)-16可以改變MIN6B1細胞的mRNA及基因的表達，誘導MIN6B1細胞增殖。表明骨骼肌來源的外泌體可以將脂肪酸作用傳遞下去，促進其他細胞胰島素抵抗的發生[16]。

同樣的，高脂飲食喂養B6小鼠脂肪組織來源的外泌體可以被外周血單核細胞攝取，并分化為巨噬細胞，同時，其分泌的腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6增加。而將該外泌體注射到野生型C57BL/6小鼠體內，可引起其發生胰島素抵抗。表明脂肪組織來源的外泌體作為脂肪組織與巨噬細胞相互作用的橋梁，介導了代謝性疾病的發生[17]。

2 妊娠糖尿病時外泌體水平的變化及機制

2.1 妊娠糖尿病時血漿外泌體水平升高 正常妊娠期間，機體會發生一些代謝變化，妊娠早期脂肪沉積增加，妊娠晚期可發生胰島素抵抗及脂解作用增加，胎盤在介導母體生理改變與胎兒發育中發揮了關鍵作用。孕期前3個月時，細胞滋養層細胞、滋養層細胞、絨毛外滋養層細胞、胎盤間充質干細胞在細胞外環境改變(如氧濃度發生變化)時可以釋放外泌體[18]。細胞外囊泡特別是外泌體里包裹著許多的蛋白、miRNA及磷脂，在維持胎兒與母體間信息傳遞中發揮重要作用。在一項縱向研究中發現，妊娠期間血漿胎盤來源的攜帶人胎盤堿性磷酸酶(PLAP)的外泌體濃度增加，且與平均子宮動脈血流有關。與未妊娠女性相比，妊娠女性血漿外泌體濃度增加50倍，并且在整個妊娠期間，外泌體的濃度都是增加的[9]。其中從妊娠6周開始，母體血漿中即可檢測到外泌體，在妊娠6～12周時增加。同時，在病理生理狀態下，如先兆子癇、妊娠糖尿病，外泌體濃度會有很大變化[19]。研究顯示，與正常妊娠女性相比，妊娠糖尿病患者外泌體水平顯著升高。與妊娠時血糖水平正常女性相比，妊娠糖尿病患者在妊娠11～14周時，母體血漿總的外泌體水平升高2倍。與正常妊娠女性相比，妊娠糖尿病患者在孕早期PLAP+外泌體濃度約增加1.6倍，孕中期時約增加1.5倍，孕晚期時約增加1.3倍[20]。

2.2 妊娠時外泌體水平升高的機制

2.2.1 高糖 外泌體的生物合成與釋放受葡萄糖濃度影響。Rice等[18]將孕期前3個月滋養層細胞在D-葡萄糖(5 mmol/L或25 mmol/L)及1%、3%、8% O2的條件下培養48 h。結果發現，與對照組相比，在不同氧濃度條件下，高糖(25 mmol/L)都可以促進滋養層細胞釋放外泌體(P<0.001)。體外實驗證實，妊娠糖尿病患者胎盤來源的外泌體可以促進內皮細胞釋放IL-8、TNF-α。高糖可以增加內皮細胞分泌外泌體的數量，改變外泌體蛋白及RNA的成分，但并沒有改變外泌體的大小。

Sáez等[10]從低糖(5 mmol/L)、高糖(25 mmol/L)培養基中培養的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)分離得到外泌體，再分別與高糖或低糖濃度培養的HUVEC共孵育，結果發現，高糖可以增加HUVEC釋放外泌體數量，促進內皮損傷修復及增加磷酸化內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、人陽離子氨基酸轉運蛋白-1(hCAT-1)、血管內皮生長因子及細胞間黏附分子-1的表達。高糖培養基培養的HUVEC提取的外泌體也可以增加低糖培養基培養的HUVEC損傷修復及磷酸化eNOS、hCAT-1、血管內皮生長因子的表達，而低糖培養基中HUVEC提取的外泌體能夠逆轉高糖對內皮細胞損傷修復的影響，使hCAT-1 mRNA的表達恢復至正常水平。

2.2.2 低氧 妊娠糖尿病時血糖升高及低氧都可以改變外泌體的水平及生物活性。低氧誘導因子-1是外泌體生物合成的重要條件因子，多種病理生理狀態下檢測到低氧誘導因子-1介導的細胞間外泌體的信號轉導。內皮細胞遷移及血管新生增加是細胞對缺氧的反應。越來越多的證據表明，外泌體參與介導了這些血管改變。妊娠期間，低氧可以觸發外泌體信號，增加胎盤血管新生，增強細胞滋養層侵襲和增殖，以保護胎兒免受氧化應激損傷[21]。研究發現，使用不同氧濃度(1%、3%、8%)培養細胞滋養層細胞，發現低氧(1%)可促進外泌體的產生以及細胞侵襲與增殖[22]。

2.2.3 肥胖 妊娠時，為了維持對胎兒的營養供給，母體的脂肪量增加。但是脂肪組織增生肥大與代謝異常及胰島素抵抗密切相關[23]。研究顯示，外泌體的釋放依賴于體重。肥胖者與瘦者脂肪組織外泌體的濃度不同[24]。與瘦的動物相比，肥胖動物脂肪細胞分泌更多的外泌體，進一步研究顯示，這些外泌體是由瘦的脂肪組織分泌的。分析其原因可能是瘦的脂肪組織中的脂肪細胞數量更高，從而導致外泌體的數量增加[25]。

母親高的體重指數與總的外泌體濃度增加有關，同時內皮細胞IL-6、8及TNF-α的釋放增加，表明外泌體在妊娠期間可以調節母體的系統性炎性反應。母體血漿外泌體水平與母親的體重指數密切相關，體重指數很高的患者，PLAP+外泌體與總外泌體的比值較低[26]。有學者證實，妊娠糖尿病時，外泌體數量的增加是由于總的外泌體增加而不是PLAP+外泌體數量增加[20]。然而，這些額外的循環外泌體的出現在肥胖與妊娠糖尿病發生中的作用尚不明確，還需進一步研究。

3 異常表達的外泌體對妊娠糖尿病的影響機制

3.1 外泌體與L-精氨酸/一氧化氮信號通路 內皮細胞外泌體可以調節PI3K/eNOS信號通路，在妊娠糖尿病患者胎兒胎盤的內皮功能調節中發揮作用。外泌體攜帶miRNA-203，后者可以誘導eNOS活性，因此推測妊娠糖尿病患者胎兒血循環外泌體中可能也攜帶miRNA-203，從而影響胎兒內皮細胞的功能[27]。還有研究顯示，合體滋養層細胞來源的外泌體內含有eNOS，可以調節一氧化氮的產生[28]。從妊娠糖尿病患者臍靜脈內皮細胞分離獲得的外泌體，通過hCAT-1可以增加L-精氨酸的運輸[29]。上述研究表明，妊娠糖尿病患者外泌體在胎兒循環中可能發揮潛在的作用，誘導胎兒胎盤內皮功能異常。

3.2 外泌體與內皮激活 外泌體與內皮細胞在體外共培養，可以上調內皮細胞分泌細胞因子。對HUVEC的研究發現，與來自正常妊娠女性體內的外泌體共培養，使其粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、IL-4、IL-6、IL-8、干擾素-γ、 TNF-α的釋放增加約1.8倍，而與來自妊娠糖尿病患者體內的外泌體共培養，細胞因子的釋放增加約3倍[19]。母體循環來源的外泌體可以促進內皮細胞遷移。與未妊娠女性相比，從妊娠女性體內分離的外泌體促進內皮細胞遷移的作用更強(P<0.05)。

從未良好控制血糖的糖尿病患者多種不同類型的細胞中分離得到的外泌體都包含有TNF-α。TNF-α是重要的炎性因子，外泌體通過它在炎性反應及內皮細胞功能中發揮調節作用[30]。將HUVEC與單核細胞來源的外泌體共培養，發現內皮的促凝性、細胞凋亡及血管新生增加，表明單核細胞來源的外泌體也參與了內皮功能紊亂的發生[31]。

3.3 外泌體與氧化應激 多項研究顯示，外泌體可以影響氧化應激。其可誘導微血管內皮細胞產生活性氧簇，增加NAPDH氧化酶的活性[32]。將正常孕婦臍靜脈內皮細胞與來自妊娠糖尿病患者臍靜脈內皮細胞的外泌體共孵育，可以誘導eNOS活性及一氧化氮合成增加[29]。同樣，來自正常孕婦臍靜脈內皮細胞的外泌體可以使高糖誘導這些細胞發生的功能異常得到逆轉[10]。

3.4 通過miRNA調節基因表達 外泌體中的核酸種類非常豐富，包含DNA、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等，在細胞間的遺傳物質信息傳遞過程中發揮重要作用。外泌體miRNA的傳遞可干預靶細胞內目標mRNA的轉錄及蛋白質的生成，誘導靶細胞短暫或持續性的表型變化，參與調節多種生理和病理過程。越來越多的研究關注外泌體中胎盤特異性miRNA即染色體19miRNA簇(C19MC)，它由58個miRNA組成，定位于染色體19q13.41，特異性表達于人類胎盤及未分化的細胞[33]。研究發現，與正常妊娠女性相比，妊娠糖尿病患者胎盤來源的外泌體特異性C19MC miRNA，包括miRNA-518a-5p、miRNA-518b、miRNA-518c、miRNA-518e、miRNA-520c-3p、miRNA-525-5p表達增加，與病理性妊娠(如妊娠糖尿病)密切相關[34]。外泌體內滋養層細胞特異性分泌的C19MC miRNAs在胎盤與母體信息交流中發揮重要作用，可能參與母體對妊娠過程的適應。

綜上所述，妊娠糖尿病時由于高糖、低氧、母體體重增加導致外泌體水平升高，其可能作為一種生物標志物，用于妊娠糖尿病的診斷。同時，升高的外泌體還可通過誘導一氧化氮合成、氧化應激、內皮功能紊亂，以及通過釋放miRNA調節基因表達，進一步影響妊娠糖尿病的進展。外泌體在妊娠糖尿病發生中的作用是因還是果，仍需深入研究。