ABT-263對順鉑耐藥食管癌細胞的抑制作用

林慶煥 丁茸 畢婷婷 林健 鄧貴華

[摘要] 目的 研究ABT-263對順鉑耐藥食管癌細胞EC109/CDDP的作用。 方法 采用MTT法檢測ABT-263對耐藥細胞EC109/CDDDP及其親代細胞EC109的細胞毒作用;通過克隆存活實驗檢測ABT-263對食管癌細胞再生能力的影響;流式細胞術檢測細胞凋亡的情況，并通過Western blot檢測細胞PARP蛋白的變化。 結果 MTT實驗結果顯示ABT-263對EC109及EC109/CDDP的細胞活力均有顯著抑制作用;克隆存活實驗結果顯示ABT-263可以抑制食管癌細胞的再生能力（P < 0.01）;流式凋亡結果分析顯示ABT-263誘導食管癌細胞發生細胞凋亡（P < 0.01）;Western blot結果顯示ABT-263顯著上調細胞PARP蛋白的剪切（P < 0.05或P < 0.01）。 結論 ABT-263抑制食管癌EC109/CDDP細胞及其親代細胞EC109的細胞活力和增殖能力，誘導細胞發生凋亡。

[關鍵詞] ABT-263;食管癌;順鉑耐藥;凋亡

[中圖分類號] R730.23? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（b）-0012-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of ABT-263 on cisplatin-resistant esophageal cancer cell line of EC109/CDDP. Methods The cytotoxicity of ABT-263 in the cisplatin-resistant cell line EC109/CDDP and its parental cell line EC109 was measured by MTT assay. Colony formation assay was used to determine the effect of ABT-263 on cell renewable capacity of esophageal cancer cells. Flow cytometry was adopted to detect cell apoptosis. Western blot was used to investigate the changes of protein expression of PARP. Results MTT assay results showed that ABT-263 significantly inhibited the cell viability of EC109 and EC109/CDDP. Colony formation assay indicated that ABT-263 inhibited the cell renewable capacity of esophageal cancer cells （P < 0.01）. Flow cytometry analysis revealed that ABT-263 induced apoptosis of esophageal cancer cells （P < 0.01）. Western blot results showed that ABT-263 significantly increased the protein expression of cleavage PARP （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion ABT-263 exhibits cytostatic and cytotoxic effects on cisplatin-resistant esophageal cancer cell line EC109/CDDP and its parental cell line EC109， while it induces apoptosis.

[Key words] ABT-263; Esophageal cancer; Cisplatin-resistant; Apoptosis

食管癌作為最常見的八大癌癥，在全世界范圍內增長迅猛，患者死亡率高，而我國也是世界上食管癌最為高發的地區之一[1-3]。順鉑作為在腫瘤治療中應用最廣泛有效的化療藥物之一，對包括食管癌在內的多種實體瘤和血液惡性腫瘤具有很好的治療效果[4]。但是，隨著腫瘤細胞對順鉑產生耐藥性，對耐藥細胞的治療已經成為新的挑戰[5]。ABT-263作為一種新型Bcl-2家族蛋白抑制劑，不僅能通過抑制抗凋亡Bcl-2家族蛋白促進腫瘤細胞發生凋亡，而且對紫杉醇耐藥的前列腺癌細胞也有抑制作用[6-8]。本研究主要以ABT-263處理順鉑耐藥食管癌細胞EC109/CDDP及其親代細胞EC109，檢測藥物能否有效抑制細胞的增殖和再生及其對細胞凋亡的影響，探討ABT-263對順鉑耐藥食管癌細胞的體外抑制作用。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

人源食管鱗癌細胞株EC109來源于中國醫學科學院腫瘤研究所（北京），順鉑耐藥細胞株EC109/CDDP來源于南方醫科大學藥學院[9]。ABT-263購于美國Sellsck公司;RPMI-1640培養基、胎牛血清、雙抗（青霉素/鏈霉素）、胰蛋白酶、蛋白Marker購于美國Gibico公司;MTT、二甲基亞砜（DMSO）、蘇木精染料購于美國Sigma公司;PBS粉末購于廣州展晨生物技術有限公司;RIPA蛋白裂解液、RIPA Lysis Buffer、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白酶抑制劑混合物Protease Inhibitor Cocktail購于北京康為世紀生物科技有限公司;蛋白上樣緩沖液、LDS Sample buffer購于美國Invitrogen公司;PVDF膜購于瑞士羅氏公司;ECL化學發光試劑盒、PARP抗體、β-actin抗體、二抗羊抗兔IgG購于美國CST公司;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于美國BD公司。

1.2 細胞培養

使用RPMI-1640培養基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素）于37℃、5%CO2環境下對食管癌細胞進行常規培養，對數生長期進行傳代處理。

1.3 MTT法檢測ABT-263對食管癌細胞活力的影響

取對數生長期的食管癌細胞EC109和EC109/CDDP用胰蛋白酶進行消化、離心并計數。根據計數結果，取適量細胞懸液，以3000個/孔接種于96孔板中靜置過夜。分別加入0、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L的ABT-263處理細胞48 h后，換用含MTT（5 mg/mL）的培養基繼續培養4 h，去除培養基并加入DMSO（150 μL/孔），振蕩后用酶標儀在570 nm波長處檢測OD值。計算各濃度組平均OD值，以0 μmol/L為對照，計算各孔OD值相對0 μmol/L濃度平均值的相對吸光率，以100%減去各孔相對吸光率計算抑制率并繪制抑制率曲線。

1.4 克隆存活實驗檢測ABT-263對食管癌細胞再生能力的影響

細胞接種于6孔板后，對照組和實驗組分別加入1‰的DMSO（ABT-263 0 μmol/L）和10 μmol/L的ABT-263對細胞進行常規培養48 h。收集細胞，離心并計數后以3000個/孔接種于6孔板中，將細胞放置于培養箱中常規培養12～14 d，每2天更換一次培養基，直至克隆斑形成。去除培養基并用PBS溶液洗滌，接著用95%乙醇固定，最后用蘇木精染料對細胞進行染色并對克隆斑進行計數。

1.5 Annexin V-FITC檢測ABT-263對食管癌細胞凋亡的影響

細胞接種于6孔板后，對照組和實驗組分別加入1‰的DMSO和10 μmol/L的ABT-263處理細胞48 h。用不含EDTA的胰酶將細胞消化后收集于離心管中，1200 r/min離心5 min，用4℃預冷的PBS溶液清洗細胞;取3 mL的1×Binding buffer將細胞重懸并轉移至流式管中，離心后輕輕棄去上清液，每管用100 μL的1×Binding buffer將細胞重懸并加入5 μL的Annexin V-FITC染料，室溫下避光孵育15 min后再加入400 μL的1×Binding buffer并混勻，之后上機檢測，通過FlowJo 7.6軟件對結果進行分析處理。

1.6 Western blot檢測細胞凋亡相關蛋白PARP的變化

細胞接種后，對照組和實驗組分別加入1‰的DMSO和10 μmol/L的ABT-263處理細胞48 h。之后將培養皿置于冰上，加入60 μL/皿的預冷RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑）充分裂解后提取蛋白于預冷的1.5 mL EP管內。BCA法測定蛋白濃度后，依比例將蛋白樣品的濃度進行歸一化后，100℃金屬浴加熱5 min。垂直電泳槽內加入20 μL/孔的蛋白樣品，并對蛋白樣品進行分離，轉膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉膜1 h后，一抗4℃孵育過夜。取出PVDF膜在搖床上用1×TBST漂洗液清洗3次，每次10 min。之后對條帶二抗室溫孵育1 h，用1×TBST洗膜6次，每次5 min，加ECL發光液顯影。

1.7 統計學方法

應用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計學分析和圖表制作，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ABT-263對EC109和EC109/CDDP細胞活力的影響

ABT-263處理能夠明顯抑制食管癌細胞EC109和EC109/CDDP的細胞活力，且抑制作用具有濃度依賴性。其對EC109和EC109/CDDP細胞的IC50值分別為（10.47±0.30）μmol/L和（8.72±0.62）μmol/L。

2.2 ABT-263對EC109和EC109/CDDP細胞再生能力的影響

經過ABT-263處理的食管癌細胞EC109和EC109/CDDP再生能力均受到明顯抑制。以對照組（ABT-263 0 μmol/L）克隆斑數目為100%，ABT-263處理后EC109和EC109/CDDP細胞的克隆斑數目分別為（68.53±3.73）%和（54.64±2.22）%。與對照組比較，EC109和EC109/CDDP細胞克隆斑數目均減少，差異有高度統計學意義（t = 7.95、23.92，均P < 0.01）。

2.3 ABT-263對EC109和EC109/CDDP細胞凋亡的影響

ABT-263處理食管癌細胞48 h后，實驗組（ABT-263 10 μmol/L）細胞凋亡明顯多于對照組（ABT-263 0 μmol/L）[EC109：（9.79±0.84）%比（3.77±0.16）%;EC109/CDDP：（22.34±1.19）%比（9.73±0.16）%]，差異有高度統計學意義（t = 9.93、14.88，均P < 0.01）。

2.4 ABT-263對EC109和EC109/CDDP細胞PARP蛋白表達的影響

與對照組（ABT-263 0 μmol/L）比較，實驗組（ABT-263 10 μmol/L）EC109及EC109/CDDP細胞PARP蛋白的剪切明顯上調（t = 9.71，P < 0.05;t = 16.87，P < 0.01）。

3 討論

食管癌主要分為鱗狀細胞癌和腺癌兩大類。食管鱗癌在發展中國家中較為常見，其可能發生于整個食管部位，作為最致命且研究最少的癌癥之一，其長期預后情況非常糟糕，總體5年生存率為15%～25%[10-11]。當前食管癌的治療多采用多模式的治療方式，其中化療以及輔助性化療依然是最重要的手段之一，而順鉑在食管癌化療中占據著不可或缺的地位[11-13]。但是，化療中腫瘤細胞對藥物產生耐藥性仍然是順鉑化療所面臨的最大挑戰。

ABT-263能選擇性抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl和Bcl-w，進而誘導腫瘤細胞發生凋亡[7]。有文獻報道ABT-263能夠抑制食管癌細胞的增殖并誘導細胞凋亡[14]，我們此前的研究也發現該藥物能夠誘導食管癌細胞發生G1/G0周期阻滯、凋亡和自噬[15]。為了進一步探討ABT-263對順鉑耐藥食管癌細胞的作用，本研究采用ABT-263處理順鉑耐藥細胞EC109/CDDP及其親代細胞EC109并檢測細胞活力、細胞再生能力以及細胞凋亡情況。實驗結果顯示ABT-263對食管癌親代細胞和順鉑耐藥細胞的細胞活力和再生能力均有顯著抑制作用，且能夠誘導細胞發生凋亡，抑制腫瘤細胞的生長。

順鉑主要通過與腫瘤細胞DNA結合并導致其損傷從而誘導細胞凋亡發揮抗腫瘤作用。然而，順鉑化療的過程中常受到其獲得性耐藥的限制。順鉑獲得性耐藥的主要機制包括減少藥物蓄積和增強藥物滅活、促進DNA修復、抑制凋亡信號傳導和間接調控因子的改變等[16]。已有研究表明，自噬作為腫瘤細胞的一種保護機制，抑制其作用能夠提高順鉑對耐藥食管癌細胞的抗腫瘤作用[17]。此外，C-末端結合蛋白-2和食管癌相關基因-2也能夠通過影響腫瘤細胞凋亡通路從而調節耐藥細胞對順鉑的敏感性[18-19]。而銅離子轉運蛋白-1的表達下調介導了順鉑誘導的食管癌細胞EC109耐藥[9]。本研究結果顯示ABT-263處理耐藥細胞EC109/CDDP能夠抑制細胞活力和再生能力，這很可能是通過誘導腫瘤細胞發生凋亡而完成。盡管發生凋亡的機制尚不明確，但是PARP蛋白剪切的上調提示caspase通路對其產生作用[15，20]。同時我們還發現，相同濃度的ABT-263處理食管癌細胞，耐藥細胞受到的抑制作用比親代細胞更強，顯示其對順鉑耐藥細胞的抑制優勢。以上結果提示ABT-263或許能夠給順鉑耐藥食管癌的治療提供新的選擇和思路，其體內抗癌活性及具體機制仍待進一步的研究探討。

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（收稿日期：2018-07-29? 本文編輯：羅喬荔）