絞股藍皂苷XLIX的研究概況

胡曉安 胡萌萌 吳 晗 馬鵬飛 張 莉

1.陜西省食品藥品監督檢驗研究院，陜西西安 710061；2.西安京西雙鶴藥業有限公司，陜西西安 710061;3.陜西省中醫醫院，陜西西安 710065

絞股藍Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino，又名七葉膽、遍地生根、公羅鍋底、小苦藥、五葉參、日本名甘茶蔓[1]等，是葫蘆科絞股藍屬多年生攀援草質藤本植物[2]。味甘、苦，性寒，歸肺、脾、腎經。絞股藍中含有皂苷、多糖、黃酮、甾醇類、氨基酸及微量元素等多種化學成分[3-5]。目前普遍認為皂苷、黃酮等是其主要活性成分，已知含有包括絞股藍皂苷A、絞股藍皂苷XLIX 等140余種絞股藍皂苷以及商陸素、蘆丁、槲皮素等10余種黃酮類成分[6]，是目前所知非五加科人參屬植物中唯一含有人參皂苷類成分的植物[3]。該屬植物基源復雜、品種繁多，全世界已知絞股藍屬植物有17種、2變種，我國有14種、2變種[7]，其中9種、2變種為我國特有種。絞股藍多分布于亞熱帶和北亞熱帶地區，我國主要分布于秦嶺和長江以南地區[8]，其中陜西安康的平利縣、寧陜縣盛產絞股藍，因此平利被列為中國絞股藍原產地。

絞股藍總苷（gypenoside）是以絞股藍為原料經提取分離制成的總苷原料藥，其藥品制劑有絞股藍總苷片[9]、絞股藍總苷膠囊[10]等，臨床功能主治養心健脾，益氣和血，除痰化瘀，降血脂。用于高血脂癥，見有心悸氣短，胸悶肢麻，眩暈頭痛，健忘耳鳴，自汗乏力或脘腹脹滿等心脾氣虛，痰阻血瘀者[11-12]。

在絞股藍的皂苷類、黃酮類、多糖類、維生素、氨基酸等多種生理活性物質中，其中皂苷類是其主要活性成分[13]，日本學者家竹本常松于1983年在絞股藍中發現絞股藍皂苷XLIX（CAS號：94987-08-3），并對其進行結構鑒定和確證[14]。藥理學研究表明，絞股藍皂苷XLIX具有抑制腫瘤生長、保護心腦血管系統、降低血糖、調節血脂平衡、減少氧化應激等作用[15-19，31]。其含量在絞股藍總苷中高達6%～20%，為其中含量最高的活性特征成分之一[19]，且專屬性強，目前尚未發現在其他科屬植物中該組分的報道。

1 絞股藍皂苷XLIX的提取與純化[6，20]

絞股藍總皂苷原料提取純化用正相硅膠短柱，首先用乙醇洗脫，再用氯仿、乙酸乙酯、甲醇組成的流動相采用極性增加的梯度進行洗脫，分別收集得到10個餾分（A-J），評價其對VCAM-1的抑制活性，經重新分級后產生6個級分（J-1～6）。 將包含絞股藍皂苷XLIX級分的J-6使用制備液相進一步純化，色譜條件：制備柱C18， 用33%乙腈水洗脫液等度洗脫，檢測波長206nm。經純化的絞股藍皂苷XLIX含量可達到98%以上。

2 絞股藍皂苷XLIX的結構鑒定和確證

絞股藍皂苷XLIX屬達瑪烷型四環三萜皂苷[3]。其分子結構特點是分子中C8位有β構型的角甲基。C13位有β氫，C10位有β醛基，C14位有α甲基，C17位有β側鏈，C20位為S構型，苷元的C3位連有鼠李糖、木糖和阿拉伯糖構成的糖鏈，C20位連有葡萄糖。根據13C-NMR，DEPT，MS 及元素分析確定分子式為C52H86O21，分子量為1047.23，Liebermann反應陽性。IR：在3418cm-1，1044cm-1處有強的羥基吸收；在1701cm-1處有一羰基吸收峰；1379cm-1，1260cm-1處有四環三萜的特征吸收峰。其乙?；锏腎R譜無羥基吸收。1H-NMR譜在δ 5.02ppm（1H，d，J=7.89 Hz）處多一個質子信號，歸屬于葡萄糖的端基質子。13C-NMR譜中C21δ 66.87ppm向低場位移至76.36ppm，說明分子中C21羥基與糖結合成苷。δ46.13，76.31及36.70ppm各信號分別歸屬于C17，C20及C22。受C21羥基苷化的影響，各碳原子分別位移-0.06，-0.20和+0.05ppm，多出一組葡萄糖信號，分別為δ106.25，75.54，78.65，71.82，78.71和62.93ppm。經綜合解析，確定其結構見圖1。

圖1 絞股藍皂苷XLIX結構式

3 絞股藍皂苷的藥理作用

絞股藍中含有多種皂苷、黃酮、氨基酸以及多糖等活性成分，自1976年日本學者從絞股藍中分離出達瑪烷型皂苷以來，各國學者已經從絞股藍中提取得到了上百種絞股藍皂苷[21-23]，并一直研究其藥理作用。目前已經證實絞股藍皂苷具有降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗阿爾茨海默病、抗焦慮、抗衰老、鎮靜催眠、降血糖以及免疫調節等作用[15-18]，其中養心健脾、益氣活血、除痰化瘀、降血脂作為明確療效寫入了絞股藍總皂苷說明書中。

3.1 調節血脂、抗動脈粥樣硬化

絞股藍皂苷可有效預防和治療高脂血癥以及動脈粥樣硬化，這種調節血脂的作用與抑制脂肪細胞產生游離脂肪酸及促進合成中性脂肪有關[21，23]。絞股藍皂苷能夠不同程度地降低高脂動物血清中的總膽固醇（TC），甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL）濃度，顯著增加血液中的高密度脂蛋白（HDL），并且可顯著降低內皮素（ET），從而降低動脈粥樣硬化的發病率，在預防和治療心腦血管疾病新藥研發方面具有開發價值[8，25]。

3.2 抗腫瘤作用

絞股藍皂苷具有顯著的體內外抗腫瘤作用[8]，研究表明其可以明顯抑制體外培養結腸癌細胞、腫瘤細胞、腎上腺皮質癌細胞以及人急性白血病細胞增殖，同時對正常細胞增殖無不良影響[8]。在小鼠結腸癌模型中用絞股藍總皂苷連續給藥出現顯著療效，與5-氟尿嘧啶協同化療時療效顯著；絞股藍總皂苷在體外能有效抑制人的腎上腺皮質癌細胞（ACC SW-13）的增殖，其機制可能與上調caspase-8 m RNA的表達相關[26]。絞股藍總皂苷可改變人急性白血病細胞（HL-60）的形態，降低細胞活性， 誘導G0/G1期細胞停滯，使DNA破碎，并促使HL-60細胞凋亡[27]。

3.3 抗阿爾茲海默病

阿爾茨海默?。╝lzheimer disease，AD）是一種中樞神經系統變性病，起病隱襲，病程呈慢性進行性，是老年期癡呆最常見的一種類型。姚柏春等[24]探討了絞股藍皂苷（GPM）改善癡呆小鼠學習記憶能力的作用及機制，絞股藍皂苷能對抗自由基的氧化損傷、修復線粒體的超微結構進而改善SDAT鼠的認知能力，其機制可能與其減輕腦組織抗氧化損傷、減少Aβ表達有關[24]。本研究有希望用于人類老年癡呆癥疾病的治療，為絞股藍資源的開發利用提供依據。

3.4 降血糖作用

糖尿病已成為世界第3大慢性疾病，研究表明絞股藍降血糖作用的主要成分是皂苷與多糖。近年發現其作用機制可能與激活Nrf2信號通路有關[23]。研究發現，絞股藍內生真菌JY25多糖對α-葡萄糖苷酶有競爭性抑制作用，與糖尿病臨床防治藥物阿卡波糖的抑制類型相同，具有開發成新型降血糖藥物和保健品的潛能[23]。

3.5 抗衰老作用

研究發現，絞股藍提取液的抗衰老作用主要通過增強血液超氧化物歧化酶（SOD）活性，同時降低自由基活性而實現的[28]。絞股藍皂苷能阻止脂質過氧化，減少Ca2+內流，明顯抑制谷氨酸鹽下調Bcl-2蛋白、上調Bax蛋白表達，進而降低谷氨酸引起的細胞凋亡[29]；絞股藍皂苷還可以通過減少細胞內過氧化物的堆積，降低谷胱甘肽（GSH）的消耗，增加細胞內GSH 含量[8]。

3.6 鎮靜催眠作用

江硯等[30]研究發現絞股藍總皂苷具有明顯的鎮靜、催眠作用，能顯著延長閾上劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠時間[8]。GABA對哺乳動物中樞神經系統具有普遍的抑制作用，研究顯示其可通過介導褪黑素促進睡眠。絞股藍總皂苷不僅可顯著降低大鼠下丘腦內DA、NE含量，還可使IL-lβ含量增高[23，30]。

3.7 抗焦慮作用

絞股藍總皂苷連續給藥可恢復由慢性足底電擊應激導致的小鼠大腦內DA和5-羥色胺水平降低情況，并且可調節c-Fos蛋白的表達水平和腎上腺皮質的水平，改善小鼠的焦慮癥狀[23]。

3.8 免疫調節作用

絞股藍中發揮免疫調節作用的主要成分是皂苷與多糖[23]。研究表明，絞股藍總皂苷連續用藥可增強正常小鼠淋巴細胞的增殖，可顯著增強巨噬細胞的吞噬功能，提高免疫器官指數，提高小鼠血清溶血素含量，對細胞免疫和體液免疫都有增強的作用。能提高正常機體非特異性免疫能力[22-23]。

絞股藍其良好的臨床療效已經在長期、大量實踐中得到證明，近年來，以絞股藍為主研發的保健食品層出不窮，而以絞股藍總皂苷涉及的藥品劑型也是豐富多樣，包括片劑、膠囊劑、滴丸劑、軟膠囊劑、顆粒劑等，幾乎涵蓋了所有口服劑型。另外絞股藍總皂苷由于其確切的降脂作用，寫入了相關制劑的說明書中，與化學降脂藥品相比較，其無明顯副作用，且在降脂的同時，能明顯控制血糖升高與減少糖尿病作用。

4 絞股藍皂苷XLIX的藥效機制研究

從20世紀80年代起，有關絞股藍及提取物總苷的藥理研究報導甚多，充分證明了其具有降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗阿爾茨海默病、抗焦慮、抗衰老、鎮靜催眠、降血糖以及免疫調節等作用[15-18]，并在長期的臨床應用中證明了其確切療效，未見不良反應的報導，但絕大部分是對絞股藍總苷原料藥及制劑的藥理研究，而對有效單體成分的藥理活性和作用機制缺乏深層次的研究。絞股藍皂苷XLIX是絞股藍中的主要活性成分之一，Huang等[31]在2007年對絞股藍皂苷XLIX分子的抗炎、抗癌和抗動脈粥樣硬化作用機制進行了深入研究，結果表明絞股藍皂苷XLIX是一種天然的選擇性過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）-α激活劑，其活性類似于Wy-14643， 通過PPAR-α途徑產生抗炎，抗癌和抗動脈粥樣硬化作用的機制有以下六點。

4.1 抑制核因子-κB的激活[31-32]

核因子-κB（NF-κB）體系主要涉及機體防御反應、組織損傷和應激、細胞分化和凋亡以及腫瘤生長抑制過程的信息傳遞，在炎癥的產生中起重要作用。在Huang等[31]的研究報告中進一步證明了絞股藍皂苷XLIX作為過氧化物酶體增殖物活化受體（PPAR）-α激活劑，除了能夠調節脂質代謝外，還能減少NF-κB活化，終止炎癥通路的激活。通過研究絞股藍皂苷XLIX（Gyp-XLIX）對細胞系中內毒素（LPS-）和腫瘤壞死因子（TNF-α）誘導的I-κBα抑制和NF-κB活化的影響。 以PDTC為吡咯烷二硫代氨基甲酸作為陽性對照，結果顯示陽性對照PTDC完全抑制了由LPS誘發的RAW 264.7巨噬細胞中NF-κB啟動子的活化，絞股藍皂苷（GP）提取物和Gyp-XLIX也有效地抑制了NF-κB啟動子活性[32]。

4.2 抑制細胞因子對于人內皮細胞表達血管粘附因子-1 （VCAM-1）的誘導作用[32]

血管細胞粘附因子-1（VCAM-1）涉及多種疾病，其中包括慢性炎癥和動脈粥樣硬化?？寡?，抗癌和抗動脈粥樣硬化藥物的一個關鍵目標就是要抑制這種粘附因子的表達式。在使用VCAM-1特異性單克隆小鼠抗體進行酶免疫測定的結果顯示，絞股藍皂苷XLIX抑制了人工培養的人臍靜脈內皮細胞中細胞表面VCAM-1的誘發。抑制VCAM-1活性是治療一些炎癥和心血管疾?。ò▌用}粥樣硬化）的重要機制之一。

在研究中進一步證實了絞股藍皂苷XLIX通過PPAR-α途徑抑制VCAM-1活性。與對Wy-14643的作用相似，特異性PPAR-α抑制劑MK-886作用完全相反，絞股藍皂苷XLIX對TNF-α刺激的VCAM-1熒光素酶活性的增加起到抑制作用。

4.3 抑制TNF-α誘導人臍靜脈內皮細胞表達VCAM-1mRNA的作用[33]

研究者在對人臍靜脈內皮細胞中TNF-α（炎癥介質）誘發的VCAM-1核糖核酸和蛋白表達式影響的實驗中，將細胞用Wy-14643，吡咯烷二硫代氨基甲酸酯，絞股藍皂苷XLIX或載體（0.1%二甲基亞砜）預處理30min。再用TNF-α刺激5h，處理后，收集核糖核酸和蛋白質，并分別通過逆轉錄聚合酶鏈反應和免疫印跡法進行分析。 結果顯示，TNF-α誘發的VCAM-1核糖核酸和蛋白質超約3倍表達，可以由吡咯烷二硫代氨基甲酸酯完全抑制，絞股藍皂苷XLIX濃度依賴性地降低TNF-α誘發的VCAM-1核糖核酸和蛋白質表達式的程度，可達到相同濃度下與正控制Wy-14643相當的程度。

4.4 抑制LPS誘導THP-1單核細胞表達組織因子的作用[34]

研究報告顯示，用不同濃度的絞股藍皂苷XLIX預處理單核細胞THP-1一定時間后，分別用RT-PCR檢測由細菌脂多糖（LPS）誘導的THP-1單核細胞TF mRNA和蛋白質表達水平。結果顯示：絞股藍皂苷XLIX減少了LPS誘導的人單核細胞TF mRNA和蛋白質的表達。表明絞股藍皂苷XLIX抑制LPS誘導THP-1單核細胞表達組織因子的表達，此機制證明絞股藍皂苷XLIX是一種PPAR-α激動劑，起到了抗動脈粥樣硬化作用。

4.5 調節游離脂肪酸代謝的作用[34]

研究表明，游離脂肪酸可通過抑制葡萄糖跨膜轉運、影響胰島素信號轉導、引起胰島細胞凋亡等多條途徑而引起胰島素抵抗。由于PPAR-α在調節脂肪代謝中起重要作用，PPAR-α激動劑可以降低血漿中游離脂肪酸的水平，達到改善胰島素抵抗、降低糖尿病發病率的目的[35-37]。絞股藍皂苷XLIX作為一種天然的PPAR -α激動劑，抑制了脂多糖誘導的THP-1在人單核細胞中的表達及活性。

4.6 改善糖尿病腎小球功能[38]

糖尿病腎?。―N）的發病率在逐年上升，其發病機制復雜，至今尚未明確[36]。趙璐等[38]對絞股藍皂苷XLIX改善糖尿病大鼠腎小球功能的作用機制進行了研究，經絞股藍皂苷XLIX治療的大鼠的尿蛋白含量、GFR、腎小球細胞凋亡比例明顯降低，而高密度脂蛋白（HDL）含量上升。模型組大鼠腎小球組織中Bcl-2蛋白表達下調而Bax蛋白表達上調、VCAM-1表達上升，絞股藍皂苷XLIX治療則可逆轉這些變化。絞股藍皂苷XLIX抑制模型大鼠腎小球細胞凋亡的試驗結果表明，降低了腎小球陽性細胞比例。絞股藍皂苷XLIX對腎小球組織蛋白表達的影響試驗結果表明，與正常組比較，模型組腎小球組織中Bcl-2蛋白表達降低，而Bax、VCAM-1蛋白表達升高。與模型組比較，中、高劑量絞股藍皂苷 XLIX 促進腎小球組織中Bcl-2蛋白表達，而抑制Bax、VCAM-1 蛋白的表達。以上研究可得出：絞股藍皂苷XLIX可降低糖尿病大鼠血糖、血脂水平，改善腎小球功能并通過PPAR-α調控VCAM-1的表達。

以上的研究結果表明，絞股藍皂苷XLIX治療動脈粥樣硬化、炎癥、心血管疾病以及糖尿病、腎病的作用機制是通過PPAR-α依賴途徑，抑制細胞因子誘導的VCAM-1過度表達式和人類內皮細胞的活性[38]。為今后開發利用絞股藍皂苷XLIX治療多種疾病提供了科學依據。

5 展望

我國絞股藍植物資源豐富，絞股藍總苷制劑及保健食品在治療動脈粥樣硬化、炎癥、心血管疾病及糖尿病中取得了可靠的效果。如能進一步深入研究，繼續開展單一組分生物活性研究，將會使絞股藍的治療進入更加廣闊的天地，對于提高人民群眾的健康和促進國民經濟發展具有重要意義。