草甘膦對菱生長、光合色素和抗氧化酶系統的影響蔡歡

吳中華

【摘 要】草甘膦是目前世界范圍內使用范圍最廣、用量最大的廣譜、滅生性除草劑。因其被大量利用于農業生產中，不僅在土壤中存在殘留，同時在水環境中檢出率也很高，對水生生態系統帶來一定威脅。本研究通過模擬實驗，選取水生植物菱（Trapa bispinosa Roxb.）于不同濃度（0，0.05，，0.1，0.3 mmol/L）的水環境中培養14天后，測定其生長、光和色素含量以及抗氧化酶活性等指標，以觀測水體中草甘膦對菱的生態毒理作用。

【關鍵詞】草甘膦；水生植物；抗氧化酶系統；菱

草甘膦是目前世界上使用范圍最廣的農藥，因其對雜草的毒害具有相對非選擇性，對深根多年生草本植物，莎草和闊葉雜草的去除都非常有效，所以常被用于農田和非耕地的除雜用（Annett et al.，2014）。草甘膦主要是通過噴施在植物葉面之后被植物內吸后，積累于植物地上的分生組織，抑制5一烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶，可以防止氨基酸苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成，使植物不能合成它生存所必需的某些芳香氨基酸，導致植物次生代謝和蛋白合成反應失衡（Bai & Ogbourne，2016；Zhong et al.，2018a；張合彩等，2018），以及莽草酸合成途徑受阻，具有受損的莽草酸代謝的植物易患各種植物病原體，植物最終死亡（范甜甜等，2017）。

草甘膦被大量使用后，其殘留物通過雨水、排灌、地表徑流以及直接排放（被用于水田雜草的去除）等方式進入水體，在水體中檢出率很高，影響水生生態系統（Borggaard & Gimsing，2008）。草甘膦進入土壤大多被土壤吸附，但在水體環境中較難分解，對水生環境帶來嚴重威脅。本研究通過模擬實驗，對菱進行不同濃度的草甘膦水溶液培養后，測定其生長指標、光合色素含量及各抗氧化酶活性，以觀測草甘膦對水生植物菱的生長、生理影響，為后續治理和修復工作提供參考。

1.材料和方法

（1）實驗材料

菱，雙子葉植物綱，桃金娘目，菱科、菱屬的一年生水生浮水草本植物。本實驗所用植物采自湖北省武漢市東湖水域。

（2）實驗方法

①實驗處理

將取得植株用自來水徹底清洗，去除黃葉爛葉后以10%霍格蘭營養液進行7天馴化，之后取生長狀況良好、大小相近的植物（并記錄初始鮮重）按實驗濃度設置（0，0.05，0.1，0.3mmol/L）進行培養，14天后收獲，測定各項指標。

實驗所使用的草甘膦均為純度≥95%的原藥粉劑。

②植物鮮重的測定

實驗結束采集樣品后，使用蒸餾水對其表面進行沖洗，去除附著物，擦干水分后用萬分天平（精確度0.1mg）稱量植株驗后鮮重（FW）。

③葉綠素含量測定

光合色素測定參考Jampeetong 和 Brixl （2009）方法加以調整，取0.1g植物葉片剪碎，放入試管中，加入10mL95%乙醇，密封置于黑暗中24h，用紫外分光度計測定470，649 和 665nm的吸光值，根據Lichtenthaler 和 Wellburn （1983）的方法計算植物葉片中的葉綠素a、b以及類胡蘿卜素含量（mg/g FW）。

④MDA及H2O2含量測定

MDA含量（mmol/g FW）用硫代巴比妥酸（TBA）法測定（王學奎&黃見良，2015）。

H2O2含量的測定，采用紫外分光光度法測定，參照Patterson等（1984）?？扇苄缘鞍缀繙y定采用考馬斯亮藍G-250法測定（mg/g FW）（Bradford，1976），以牛血清蛋白（BSA）為標準蛋白。

⑤游離脯氨酸含量測定

游離脯氨酸含量的測定則是使用快速比色法（Bates等，1973）。

⑥抗氧化酶活性測定

取植物葉片0.1g加入50mMPBSpH7.8（內含1%PVP）在冰浴下研磨， 在冷凍離心機下10000g離心10min（施海濤，2016），收集上清液，即為粗酶液，置于4℃環境中保存，用于后續指測定。

過氧化氫酶（CAT）活性采用分光光度法，以1min內吸光值A240減少0.1的酶量為一個酶活單位（U），酶活性U/（g·min FW）表示（蒼晶&趙會杰，2013）。過氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑（NBT）光化還原法測定，在560 nm處測定，以抑制NBT光化還原的50%定義為一個SOD酶活性單位?？箟难徇^氧化物酶（APX）是以抗壞血酸作為電子供體，將H2O2還原為H2O。測定時以加入H2O2為起始點，1 min內反應液在290nm波長下變化0.01為一個APX酶活力單位。

2.實驗結果

（1）相對生長率

菱在無草甘膦加入的對照組中，鮮重稍有增加。在低濃度（0.05mmol/L）草甘膦脅迫下，植物鮮重增加，相對生長率顯著上升（p=0.001）。隨著草甘膦濃度的上升，在中高濃度下植株鮮重均出現了負增長的現象，與對照組相比，高濃度草甘膦（0.3mmol/L）相對生長率顯著下降（p<0.001）。

（2）光合色素含量

和對照組相比，低濃度草甘膦環境下菱的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均顯著提高（p<0.01），與植物鮮重表現一致，尤其是高濃度草甘膦脅迫下植物光合色素含量與對照組相比表現出一定下降，其中葉綠素b受影響最明顯，降至對照組含量的57%。

（3）MDA、H2O2、可溶性蛋白和游離脯氨酸含量

MDA含量是衡量細胞膜脂過氧化水平的主要標志之一，草甘膦培養14天后，植物體內MDA含量顯著上升。而植物體內H2O2含量不因草甘膦的加入而受到明顯影響，其含量與對照組無顯著差異。菱的可溶性蛋白含量變化如表1.中所示，隨著草甘膦的加入有下降的趨勢，但在低濃度環境下并未達到顯著水平，在中高濃度草甘膦脅迫下，植物體內可溶性蛋白含量顯著降低。與對照組相比，游離脯氨酸含量受草甘膦的影響而下降，其中在高濃度下，下降水平達極顯著。

（4）抗氧化酶活性

如圖1.a，菱體內CAT活性因草甘膦的加入而下降，且下降程度與草甘膦濃度正相關。與對照組相比，CAT活性下降在高濃度草甘膦環境下達到顯著水平（p=0.005）。圖3.b所示為植物SOD活性變化，草甘膦對SOD活性影響顯著，其中在低濃度水平下表現最為明顯，在中高濃度脅迫下，酶活性下降幅度有所減緩。中低濃度的草甘膦能夠刺激菱體內APX活性提高，但隨著草甘膦濃度的進一步上升，APX活性明顯下降，顯著低于對照組水平。

3. 討論

在2016 年全球農化行業產品結構中，草甘膦在全球除草劑市場中占比約 48%，是我國最大的農藥品種，也是全球用量最大的農藥品種（楊斌，2017）。因其大量使用，所以引起了多方面對其毒性的研究。在低濃度的草甘膦處理下，菱的生長和色素含量均有一定的提高，可能是由于在植物收到一定脅迫下表現出來的應激性，以平衡外界環境帶來的機體損傷。但在高濃度條件下，植物的葉綠素水平較對照組明顯下降。許多研究表明，草甘膦可以顯著降低植物葉綠素含量（Saunders，Pezeshki，2014），草甘膦對葉綠素含量的影響是影響葉綠素的合成和加速葉綠素降解。其中葉綠素b表現最為明顯，僅降至對照組含量的57%。有研究表明，葉綠素b的含量降低會影響植物體內光系統的穩定性，從而導致光合作用的反應過程失衡，降低植物的對脅迫的耐受性。這表明，草甘膦對菱的脅迫途徑之一可能是通過影響植物體內葉綠素b含量從而降低光合作用效率，導致植物死亡（Zhong et al.，2018b）。

MDA是膜脂過氧化的主要產物，是衡量細胞膜受損程度的生物指標。在本研究中，MDA含量在三種濃度的草甘膦脅迫下均顯著提高，說明草甘膦對菱的毒害作用明顯，僅低濃度就能對其膜脂帶來明顯傷害。H2O2含量可以衡量植物受脅迫的情況，但在本實驗中，H2O2含量在各草甘膦水平下均無明顯變化，這可能是由于抗氧化系統的各種酶被激活，及時清楚了由于植物應激產生的過量H2O2。

SOD、CAT和APX是植物抗氧化系統中的主要保護酶，SOD是該保護系統中的第一道防線，可催化超氧陰離子自由基（O2-）歧化形成H2O2和O2（Wu等，2010），CAT和APX的主要功能這是清除植物體內多余的H2O2。在本實驗中，APX活性在中低草甘膦濃度條件下顯著提高，承擔了大量植物體內H2O2的清除工作，Gomes和Juneau（2016）觀察到草甘膦處理可以使浮萍積累MDA和H2O2，APX酶活性提高以平衡此種損傷。而CAT和SOD活性在草甘膦脅迫環境下顯著降低，這可能是由于植物體內H2O2含量在脅迫環境下并沒有顯著上升，不足以刺激機體酶活性提升，同時在脅迫作用下，菱的CAT和SOD在該種脅迫作用下易被破壞。

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