懸鉤子屬植物的組培快繁技術研究進展

楊鼎元，張群英*，陳 哲，李永霞

（貴州省植物園，貴州貴陽 550004）

懸鉤子屬（Rubus L.）是薔薇科（Rosaceae）中的一個大屬[1]，在我國已記錄該屬植物有194種，88變種，被分為8個組，24個亞組[2]。本屬植物大多果實多漿，味甜酸，可供食用，在歐美已作為重要水果[3]長期栽培；有些種類的果實、種子、根及葉可入藥；莖皮、根皮可提制栲膠[4]；少數種類庭園栽培供觀賞[5-6]。

我國懸鉤子資源較為豐富，不斷有新種被發現[7-10]，農藝性狀優良的懸鉤子屬植物一旦馴化種植成功，往往當年掛果，生長期可達數十年，可以使種植者獲得穩定的經濟來源。近年來[11]，國外懸鉤子屬的紅樹莓（Rubus idaeus L.）品種秋來斯（Autumn Bliss）、那好（Navaho），黑樹莓（Rubus mesogaeus） 品種薩利（Shawnee）等作為“第三代水果”被大量引入我國，產生了較高的經濟價值和社會效應。但與國外對比，我國的懸鉤子屬植物資源，未能充分開發利用；同時國外引進的懸鉤子屬植物品種極易造成品種老化，退化嚴重[12]。因此，建立一套高效的快速繁殖體系，不但有利于新品種的開發，更是擴大本土優良品種繁殖的重要手段，也可短時間內獲得大量優質組培苗以滿足種植商需求。

對懸鉤子屬植物的組織培養技術方面的研究進行了總結和展望，并探討了懸鉤子屬植物比較有價值的研究方向，旨在為將來快速繁育適合市場的優良懸鉤子屬品種及其優質栽培提供一定的科學依據。

1 懸鉤子屬植物的組培快繁技術綜述

1.1 外植體選擇

植物組織培養常用的材料是植物的組織和器官，但也有使用植物細胞作為初始材料的。外植體的污染和褐化是懸鉤子屬植物進行初代培養時必須解決的問題，選擇適宜的外植體，不但可以降低污染和褐化率，也可提高成活率，為之后的繼代增殖提供較多的材料。

在懸鉤子屬植物的組培實驗中，通常選取的外植體材料是一年生帶芽嫩莖（單芽莖段）[13,14]、莖尖[15]或以未萌發的腋芽作為材料[16-18,20]，王禹[19]認為帶腋芽的嫩枝莖段外層包裹的芽鱗片易于剝離，可以減少污染，而且在田間易于取材，王岳英[20]的研究支持這種方法。但也有研究者[14,21]認為從莖段上剝下芽并去除芽鱗片來作為接種外植體的方法對比直接滅菌接種的方法更能提高萌發率，降低污染率。究其原因，幼嫩芽體直接接觸營養物質，芽體生長點較容易吸收營養物質，從而促其萌發；而單芽莖段，接種中以莖梗接觸培養基，營養物質需經莖梗運輸到芽體，經切割和消毒后，莖梗運輸系統勢必在一定程度上受損，故芽體生長點較難吸收到營養物質，而且受消毒后變褐的鱗片束縛，故其萌發率較低[28]。

許多研究者[14-20]發現不同季節選取的同種懸鉤子屬植物材料的外植體在初代培養中以相同處理后接種的萌發率、污染率、褐變率各不相同，其研究結果均表明在每年4～5月進行的外植體初代培養往往具有較高萌發率，更低的污染率、褐化率，這可能是因為4、5月份懸鉤子屬植物處于生長旺盛期，體內激素水平較高[13]，因此萌芽率較高；6～8月份進入雨季容易造成枝條更高的污染率；9～11月份枝條木質化嚴重，導致褐化嚴重；當年12月～次年3月植株處于休眠狀態，故萌發率較低[13,14,17,20]。

1.2 外植體消毒

挑選合適的懸鉤子屬植物外植體后，在接種前須經嚴格滅菌，一般步驟如下：材料除去不需要的部分，用流水沖洗→細毛刷清洗→飽和肥皂水[13]或洗潔精[14]清洗→自來水清洗→轉移至超凈工作臺內75%酒精浸泡30S→消毒劑消毒→無菌水沖洗5遍→接種。

在懸鉤子屬植物組培中，常見的消毒劑有以下3種：①75%酒精：此濃度下的酒精具備較強滅菌效果，有利于其他消毒劑滲入，但對植物組織損傷較大故消毒時間不宜過長，因而不能徹底滅菌，須配合其他殺菌劑使用。②氯化汞（HgCl2）：又稱升汞，有劇毒，常用0.1%濃度處理5～15min，滅菌效果較強，但殘毒較大須無菌水多次沖洗，酒精加升汞的滅菌方式是懸鉤子屬植物組培中采用的最多的體外消毒方式。③次氯酸鈉：通常采用2%～10%濃度滅菌，處理時間15～30min，滅菌效果較好，易于去除，且對植物無害，須配合酒精使用加強滅菌效果。

懸鉤子屬植物表面特別是莖大多披絨毛、細刺較容易在之后環節中因表面消毒不夠徹底產生污染，郭玉霞[16]等在超凈工作臺內以滅過菌的手術刀片將絨毛細刺刮去的方法降低污染率，有研究者[20]針對這類材料采用在滅菌劑中添加數滴0.1%濃度的Tween20的方法提高外植體滅菌效果。

1.3 培養基和生長調節劑

對于懸鉤子屬植物，常見的 MS、MT、White、N6、B5、NT等培養基均能滿足懸鉤子屬植物生長需要[23]，但國內外的研究者們更多地選擇MS培養基，主要是因為無機鹽和離子濃度較高，是較穩定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含量高，其養分的數量和比例合適，能滿足植物細胞的營養和生理需要，同時Poothong[24]等人發現合理增大培養懸鉤子屬植物CaCl2、MgSO4和KH2PO4等無機鹽含量能顯著促進其生長，因此，可以認為MS培養基是非常適合懸鉤子屬植物組培的培養基種類。

在懸鉤子屬植物組織培養中主要采用6-BA（芐氨基腺嘌呤）、NAA（萘乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、6KT（N6-呋喃甲基腺嘌呤）、GA3（赤霉素）、IBA（吲哚丁酸）、C2H4（乙烯）等植物生長調節劑，但劑量在不同種類的接種材料、組培過程中的不同階段而各不相同，如表1-3所示。

表1 在懸鉤子屬植物的啟動培養中生長調節劑濃度配比

表2 在懸鉤子屬植物的增殖培養中生長調節劑濃度配比

表3 在懸鉤子屬植物的生根培養中生長調節劑濃度配比

在懸鉤子屬植物的啟動培養中均使用MS培養基，由表1可知，使用最多的生長調節劑是6-BA、NAA和GA3這3種調節劑，其中所有的懸鉤子屬植物的啟動培養都使用了6-BA，其劑量范圍從0.2～1.0mg/L，在相應報道中，均取得較高的接種萌發率。

在懸鉤子屬植物的增殖培養中均使用MS培養基，由表2可知，使用最多的生長調節劑是6-BA和NAA這2種調節劑，懸鉤子屬植物的增殖培養都使用了這2種調節劑，其劑量范圍從0.5～1.0mg/L（6-BA）、0.05～0.2mg/L（NAA），6-BA與NAA的劑量比例保持在1（6-BA）∶0.1（NAA），有研究者[29]采用響應面法優化紅樹莓組培苗增殖培養條件，其結果表明6-BA濃度在1.59mg/L時，增殖系數最高。

由表3可知，在懸鉤子屬植物的生根培養中均使用1/2MS培養基，使用最多的生長調節劑是NAA和IBA這 2種調節劑，其劑量范圍從0.05～1.0mg/L（NAA）、0.05～1.0mg/L（IBA），一方面采用1/2MS培養基，減少營養成分，加強懸鉤子屬植物的自養；另一方面添加了利于根系生長的NAA、IBA等生長調節劑促進生根，其中郭玉霞[15]等人在生根培養基底部中加入活性炭吸附營養成分，進而促進生根的方法被證實相同狀況下，生根培養基中添加少量活性炭能顯著地促進懸鉤子屬植物生根。

1.4 煉苗移栽

當懸鉤子屬組培苗生根后，就需要對瓶內苗進行移栽前煉苗處理，因為大田環境、溫室條件與組織培養的環境有很大的不同，比如光照強度、溫度、空氣濕度以及環境無菌到非無菌等差別。

1.4.1 介質選擇及消毒。種植介質通常選用疏松透氣、保水性佳易消毒滅菌的泥炭土、珍珠巖、蛭石、粗沙等。介質使用前需消毒，可用高壓、曝曬、消毒劑等方法[22]。

1.4.2 煉苗。應分階段進行，即松開組培瓶蓋1～2天→開蓋1～2天→完全打開蓋子，最后將小苗根部培養基小心沖洗干凈后再轉移到營養缽內滅菌介質中。同時應注意瓶內苗因在容器內時濕度較高，轉移最初幾天應保持小苗周圍空氣濕度在90%～100%的范圍內為佳，提高小苗成活率[18]。

1.4.3 注意環境條件。小苗移栽后因為由異養轉變為自養，應適當加強光照強度[18,29]，約在1500～3000Lx之間，如有條件，應使整個煉苗過程的溫度保持在20～25℃。

2 展望

我國懸鉤子屬植物資源十分豐富，近年來陸續有研究者不斷從中開發出新的天然產物、膳食資源、藥用活性成分[30]，如陳雪香[31]通過對懸鉤子屬植物山梅葉片內葉萜類和酚類物質分離、結構鑒定等以及抗腫瘤研究，發現山梅對于差異蛋白主要作用結直腸癌通路、氧化磷酸化通路、細胞周期、p53通路和Wnt等通路,在這些通路中對抑制腫瘤的發生發展具有重要的作用。李程[32]等通過對樹莓組培苗未生根和生根2個時期的組培苗為材料，對其各個部位的抗氧化酶活性、總酚含量及其對DPPH自由基的清除作用進行研究，發現樹莓苗具有較強的對DPPH自由基的清除能力，對于將樹莓作為藥食領域的開發與利用提供了理論依據。

雖然懸鉤子屬植物的繁殖方法簡單，但目前國內栽培的懸鉤子屬植物品種多由國外引進,其品種來源往往不確定,故極易造成品種老化，退化嚴重[12]。因此建立一套高效的快速繁殖體系，不但有利于純化國外引種品種也是擴大本土優良品種繁育時的重要手段，同時國外研究者[23]已經利用組培手段成功從受感染的懸鉤子屬植物中去除蘋果花葉病毒和樹莓叢狀矮病毒，進一步展現了組織培養技術在優化植物性狀方面的潛能。因此懸鉤子屬植物不但在產品開發上有極大研究潛力，在組培方面的研究同樣具備極大的空間。