時景仁,張文麗,賀文艷,郭晶晶,潘美晨,徐新民,郭 杰,曲 沛,王雅杰
(1.首都醫科大學附屬北京地壇醫院檢驗科,北京100015;2.首都醫科大學附屬北京天壇醫院,北京100050)
自1955年THOMILINSON等[1]首次發現腫瘤組織內低氧微環境的存在以來,大量研究發現多種實體腫瘤包括腦膠質瘤中,均存在廣泛的低氧區域[2-3]。有報道稱,隨著膠質瘤惡性程度的增加,瘤組織內的氧分壓逐漸減低,如WHO IV級膠質瘤的氧分壓僅為1%左右[4]。低氧微環境與膠質瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移、血管生成及耐藥性等密切相關[3]。低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)是介導細胞對低氧微環境進行適應性反應的關鍵性轉錄調控因子,通過參與多種靶基因的轉錄調控影響腫瘤細胞的能量代謝、增殖和凋亡等[5],在各種實體腫瘤細胞中廣泛表達。Sox2(SRYlike HMG box 2)是一種腫瘤干細胞轉錄因子,在膠質瘤細胞中異常表達[6],參與膠質瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移,以及腫瘤耐藥、復發等。本研究擬利用低氧工作站模擬體內低氧微環境,研究低氧環境對膠質瘤細胞增殖、侵襲的影響,并初步探討Sox2在低氧調控細胞增殖和侵襲中的作用。
人腦膠質瘤A172和U251細胞株購自中國醫學科學院北京協和細胞資源中心;DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司;CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所;Transwell小室、Matrigel膠購自美國BD公司;RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE及Western相關試劑購自北京普利萊公司;兔抗HIF-1α多克隆抗體、兔抗Sox2單克隆抗體購自CST公司;化學發光液購自Millipore公司。
A172和U251細胞于含10%胎牛血清的DMEM培養基中進行培養。實驗分為兩組:①常氧組,37℃、5% CO2的孵箱中培養(21%氧氣含量);②低氧組,37℃、5%CO2、93%N2的Ruskinn公司低氧工作站中培養(2%氧氣含量)。
取對數生長期的A172和U251細胞,常規胰酶消化后,血球計數板計數細胞,以每孔3×103個細胞的密度接種兩個96孔板,每組至少設置5個復孔,一板置于常氧孵箱中培養,一板置于低氧工作站中培養。分別于培養6、24、48、72 h時進行CCK-8檢測,每孔加入10μL CCK-8檢測試劑,繼續培養2 h后,在酶標儀上于450 nm處讀取吸光度值。實驗重復3次。
取對數生長期的A172和U251細胞,常規胰酶消化后,血球計數板計數細胞,以每孔5×104個細胞接種于Transwell小室中。上室預先鋪上基質膠(Matrigel),然后加入300μL無血清DMEM 稀釋的細胞懸液,下室加入700μL含20%胎牛血清的DMEM培養基,分別于常氧及低氧環境中培養24 h后,取出Transwell小室,用預冷PBS清洗2次后,再用預冷4%多聚甲醛固定15min,0.5%結晶紫染色0.5 h。小心拭去上室細胞,正置顯微鏡下計數拍照。實驗重復3次。
A172和U251細胞分別于常氧及低氧環境中培養24 h后,RIPA裂解細胞總蛋白,BCA試劑盒進行蛋白定量后,取40μg進行SDS-PAGE電泳,然后轉印至PVDF膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉1h,用兔抗HIF-1α多克隆抗體(1∶1000)、兔抗Sox2單克隆抗體(1∶1000)4℃孵育過夜,PBST洗滌3次,加入 辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶2000)室溫孵育1h,PBST洗滌3次,加入化學發光液在化學發光儀上發光成像檢測,圖像處理軟件Image J測算灰度值。實驗重復3次。
應用SPSS18.0軟件進行數據處理,所有數據均以均數±標準差表示,兩組之間差異比較采用t檢驗,P<0.05為差異具有統計學意義。
利用CCK-8實驗檢測細胞在常氧和低氧條件下分別培養6、24、48和72 h的A172和U251細胞增殖水平。結果發現,在兩種細胞中,常氧組和低氧組細胞的增殖活性均隨時間推移逐漸增加,且低氧組細胞增殖水平高于常氧組,差異具有統計學意義;但在培養至72 h時兩組細胞增殖水平無明顯差異。
圖1 常氧及低氧培養條件下A172和U251細胞增殖活性隨時間變化
采用Transwell實驗檢測A172和U251細胞在常氧和低氧條件下培養24 h的侵襲水平。結果表明,兩種細胞的低氧組穿透細胞數均多于常氧組,差異具有統計學意義,P<0.05。
圖2 常氧及低氧培養條件下A172和U251細胞侵襲能力
采用Western blot檢測A172和U251細胞在常氧和低氧條件下培養24 h的HIF-1α、Sox2蛋白表達水平,結果用HIF-1α/GAPDH 和Sox2/GAPDH 表示。結果顯示A172低氧組HIF-1α/GAPDH 為0.85±0.08,Sox2/GAPDH為1.24±0.06,常氧組HIF-1α/GAPDH為0.31±0.05,Sox2/GAPDH 為0.62±0.05;U251低氧組HIF-1α/GAPDH為0.26±0.06,Sox2/GAPDH為1.09±0.10,常氧組HIF-1α/GAPDH 為0.73±0.11,Sox2/GAPDH 為0.57±0.06。A172和U251細胞低氧組HIF-1α和Sox2蛋白表達水平均高于常氧組,差異有統計學意義(P<0.05)。
圖3 常氧及低氧培養條件下Sox2表達水平
隨著對腫瘤微環境的深入研究,人們發現腫瘤細胞中的低氧微環境是一個不容忽視的重要因素。低氧可引起腫瘤細胞發生一系列生物學改變,如細胞代謝的變化、基因表達及基因表型改變、蛋白合成變化等[7-9],從而影響腫瘤的增殖、凋亡、新生血管生成、遷移、侵襲等生物學特性[10-12]。因此利用腫瘤細胞進行體外研究時需充分考慮低氧微環境對細胞的影響。
體外構建低氧環境培養細胞系的方法主要有兩種:一是通過降低培養環境中氧分壓的物理方法,最常用的方法為通過控制三氣培養箱中氧氣或氮氣的輸入量,用傳感器來實現對氧含量的控制,進行O2、N2和CO2三氣控制,達到供氧減少的目的;二是利用化學方法使細胞用氧障礙,即在培養介質中加入氰化物[13]、連二亞硫酸鈉[14]或氯化鈷[15]等造成細胞用氧障礙或使培養基內的氧氣耗盡。但是由于三氣培養箱不是封閉裝置,不能保證整個培養過程中箱內環境尤其是氧濃度的恒定,而化學方法在誘導低氧發生的同時,還會引起其他各種生化改變,這兩種方法均不能很好的模擬腫瘤體內低氧微環境。而低氧工作站涵蓋了培養箱、活細胞工作站、生物安全柜的功能,不僅能夠嚴密控制氧氣的含量,而且當細胞需要進行處理或觀察的時候,無需從培養箱中轉入
轉出,因此箱內環境如溫度、pH值、氧濃度等均不會發生改變,能夠很好地模擬腫瘤生長微環境。
本研究利用低氧工作站構建體外低氧微環境,進行膠質瘤細胞生物學特性的研究,同時檢測了低氧誘導因子-1α(HIF-1α)的表達。結果發現,低氧環境中膠質瘤細胞的增殖及侵襲能力均高于常氧,且HIF-1α 的表達明顯增加,這與既往報道一致[3,16]。但是細胞在培養至72 h時,低氧組與常氧組增殖活性無明顯差異,考慮原因可能是96孔板面積較小,培養至72 h時兩組細胞匯合度均達到最高,因此未檢測出差異。
Sox2作為一種干細胞轉錄調控因子,不僅在腫瘤干細胞的干性維持上發揮作用,且與膠質瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、結腸癌、腦膜瘤、鼻咽部腫瘤、卵巢癌、宮頸癌等多種腫瘤密切相關[17]。臨床研究發現,Sox2在膠質瘤組織中常表現為高表達,且隨著膠質瘤惡性程度的增加表達升高[18],并與膠質瘤患者的預后密切相關[19]?;A研究發現,在膠質瘤細胞中過表達Sox2能夠促進細胞增殖、侵襲和轉移,而利用siRNA干擾其表達后,細胞增殖能力受損[20],侵襲和遷移能力也大大降低[6]。說明Sox2在膠質瘤的發生發展中發揮著重要作用。
目前關于低氧條件下膠質瘤細胞中Sox2表達水平的研究較少。為了解低氧環境中膠質瘤細胞中Sox2的表達水平,本研究利用Western blot對常氧和低氧培養條件下膠質瘤細胞中Sox2蛋白的表達情況進行了檢測,結果發現低氧組細胞中Sox2蛋白的表達水平明顯高于常氧組,表明低氧微環境促進了Sox2蛋白的表達,從而可能參與細胞增殖及侵襲能力的調控。由于Sox2的上游調控通路主要有Shh、Wnt、FGFR和TGF-β四條[21],Sox2具體通過哪條通路發揮作用需要深入研究。另外,HIF-1α和Sox2蛋白表達趨勢一致,此二者之間是否存在調節關系亦需進一步驗證。