血紅蛋白毛細管電泳和血液學指標在地貧篩查中的診斷價值

孫艷虹，鄭 丹，陸雯韻

（中山大學附屬第一醫院東院檢驗科，廣東 廣州510700）

地中海貧血又稱珠蛋白生成障礙性貧血，簡稱地貧，是由于遺傳基因缺陷導致血紅蛋白肽鏈的合成部分或完全受到抑制，從而引起的貧血或病理狀態的一種血紅蛋白病，是一組常染色體不完全顯性遺傳性疾病。目前世界上尚沒有可以治愈地貧的方法，對育齡夫婦和疑似人群進行地貧篩查在一定程度上可以減少地貧患兒的出生或盡早對地貧患者進行治療。地貧產前診斷技術規范［1］要求采用紅細胞分析用于初篩、進一步進行血紅蛋白分析，結果異常才進行基因診斷以便確診。血紅蛋白電泳分析方法包括：瓊脂糖凝膠電泳、醋酸纖維薄膜電泳法、毛細管電泳法。毛細管電泳是近些年來發展起來的一種血紅蛋白分析技術，本文擬對血紅蛋白毛細管電泳結果結合血液學指標對地貧的篩查效能進行分析，并與基因檢測進行對比，探究這兩個指標聯合檢測在地貧篩查中的診斷價值。

材料和方法

1 研究對象

收集2016年1月到2017年7月期間到中山大學附屬第一醫院東院進行地貧篩查的病例6416例，包括貧血原因待查病人和產檢孕婦，其中同時進行血細胞分析、毛細管電泳和基因檢測的病例152例，其中男47例，女105例，年齡25天至54歲。

2 儀器和試劑

血液分析采用日本希森美康公司生產的XE-5000血細胞分析儀及配套試劑；血紅蛋白電泳采用美國海倫娜公司生產的V8全自動毛細管電泳儀及配套試劑；基因檢測由達安公司檢測。

3 方法

3.1 標本的采集與處理 采集靜脈血2～3mL分置于兩管EDTA抗凝的真空采集管，輕微顛倒混勻8次后，分別送檢本院檢驗科及達安公司進行相應檢驗。

3.2 血細胞參數 采用日本SYSMEX XE-5000全自動血液分析儀及其配套試劑，根據儀器標準操作規程檢測患者的紅細胞參數，包括MCV、MCH、RBC、HB、HCT等。

3.3 血紅蛋白分析 采用美國海倫娜V8全自動毛細管電泳及其配套試劑，根據標準操作規程檢測患者的血紅蛋白電泳帶，并對電泳帶中出現的雜帶進行剔除，計算出各血紅蛋白帶的檢測值。該方法的精密度良好，變異系數（CV）≤8%，批間差≤8%；靈敏度較高，在Hb濃度≤60g／L和HbA2比例≤1.1%的樣本均可分離到清晰的A2區帶。

3.4 基因檢測 缺失型α-地中海貧血檢測：用全血基因組DNA提取試劑盒提取全血DNA，采用跨越PCR技術（Gap-PCR）方法檢測-SEA／αα、-α3.7／αα、-4.2／αα3種常見缺失型 α-地中海貧血基因；非缺失型α-地貧和β-地貧基因檢測：采用反向斑點雜交法，檢測3種α-地貧突變的野生型和突變型，包括Hb CS、Hb WS、Hb QS；采用RDB法檢測17種 β-地貧點突變，包括-28、-29、-30、-32、CD14-15、CD17、CD26（βE）、CD27-28、CD31、CD41-42、CD43、CD71-72、IVS-I-1、IVS-I-5、IVS-Ⅱ-654、CAP＋1、initiatiaon condon。嚴格按照試劑盒說明書操作，觀測結果判斷基因型。

4 結果判斷標準

4.1 紅細胞參數 MCV＜82fL、MCH＜27pg；Hb：男 ＜130g／L、女 ＜115g／L，三者中出現一個及以上時，排除缺鐵性貧血、自身免疫性溶血、其他血紅蛋白生成障礙性疾病，則疑為地中海貧血。

4.2 毛細管電泳 α-地貧：HbA2＜2.5%，或出現HbH、HbBarts、HbCS異常血紅蛋白帶；β-地貧：HbA2＞3.5%，或出現HbF＞2.0%，或出現異常血紅蛋白帶；異常血紅蛋白?。?.0%＜HbA2＜3.5%，且有其他異常血紅蛋白帶。

4.3 基因檢測 出現相應的基因缺失或點突變。

4.4 篩查結果 紅細胞參數和（或）電泳結果異常判讀為地貧可疑，篩查陽性；紅細胞參數及電泳結果均正常，判讀為篩查陰性。

5 統計學處理

采用Excel 2003軟件整理數據，采用SPSS19.0軟件分析數據。使用單樣本K-S檢驗驗證數據是否符合正態分布，服從正態分布的指標采用均值和標準差描述，組間比較采用t檢驗；不服從正態分布的指標以中位數和四分位范圍表示，進行非參數檢驗；P＜0.05表示差異有統計學意義。計算單純血紅蛋白電泳篩查、血細胞分析篩查及其聯合篩查的靈敏度、特異性、預測值，運用卡方檢驗計算各種方法是否存在顯著性差異。

結 果

1 篩查指標在地貧組和非地貧組的變化

152例病例中，進行K-S檢驗后得HCT、RBC、HB、MCV、MCH符合正態分布，HbA2不符合正態分布，根據基因檢測結果分為地貧組和非地貧組。地貧組HB、MCV、MCH水平明顯低于非地貧組，RBC水平高于非地貧組，差異有統計學意義（P＜0.05）；α-地貧的RBC水平高于非地貧組、MCV水平低于于非地貧組，差異有統計學意義（P＜0.05）；β-地貧的HB、MCV、MCH水平低于非地貧組，RBC、HbA2水平高于非地貧組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 地貧篩查指標在地貧組和非地貧組的變化

2 地中海貧血篩查結果

152例患者中檢出為疑似地貧患者的符合率為54.1%，檢出為異常血紅蛋白帶者的符合率為80%；檢出單純MCV、MCH或電泳異常者的符合率為14.5%，篩查正常者的符合率達90.9%；篩查總符合率為44.7%，詳見表2。

表2 地貧篩查結果

3 地中海貧血基因檢測結果

152例病例中，確診地貧基因攜帶55例，其中α地貧35例，占63.6%，β地貧19例，占34.5%，α＋β復合地貧1例，占1.8%?；驒z測異常的分布見表3。

表3 55例地貧確診病例基因異常分布

4 地貧篩查試驗的診斷效能評估

4.1 各血液學指標的診斷效能 采用ROC曲線計算曲線下面積及約登指數評估常用血液學指標在地貧篩查中的診斷效能。在152份樣品中，HB、HCT的曲線下面積分別是0.616、0.519，靈敏度、特異性不高，HCT在正常人與地貧患者中差異無統計學意義；MCV、MCH、RBC的曲線下面積分別是0.838、0.727、0.809，在地貧篩查中靈敏度、特異性均較高，其中MCH靈敏度最高，MCV的特異性最高，均優于RBC，具體結果見表4、圖1、圖2。

表4 紅細胞參數的診斷效能

圖1 HB、HCT、MCV、MCH的ROC曲線

圖2 RBC的ROC曲線

4.2 不同篩查策略的診斷效能 根據單純血細胞分析結果、單純毛細管電泳結果、聯合血細胞分析和毛細管電泳結果對比基因檢測結果，可知單獨血細胞和單純電泳結果異常對地貧篩查的均有較高靈敏度，但特異性相對較低；以血細胞分析及電泳結果雙異常為篩查陽性判別標準時，地貧篩查的靈敏度、特異性、準確度、陽性預測值、陰性預測值均較高。詳細見表5、表6、表7、表8。

表5 血細胞分析結果與基因結果比對

表6 電泳結果與基因結果對比

表7 血細胞分析和（或）電泳結果（任一陽性）異常與基因結果對比

表8 血細胞分析結果及電泳均異常與基因結果比對

4.3 單純電泳篩查與聯合篩查對地貧分型的價值 MCV、HbA2在 α-地貧與 β-地貧中差異無統計學意義，MCH在α-地貧與β-地貧中差異有統計學意義；MCV、MCH、HbA2均異常與單純MCH在 α-地貧、總地貧中有統計學意義，在β-地貧中差異無統計學意義。見表9。

表9 單純篩查和聯合篩查對地貧分型的價值

討 論

地中海貧血是世界上常見的單基因遺傳病，是由于珠蛋白基因缺如或突變引起珠蛋白肽鏈生成障礙，引起形成α-鏈與非α-鏈失衡的一種慢性溶血性貧血。根據珠蛋白肽鏈失衡的程度和差異，地中海貧血可根據臨床癥狀分為靜止型、輕型、中間型、重型幾種類型，輕者和靜止型患者可與正常人表現無異常，不影響正常生命活動，重型如α-地中海貧血可造成死胎、腫大胎兒，β-地貧患者多生長停滯、終身需要輸血及去鐵治療［2］，這對于地貧患者的家庭及社會均是一個沉重的經濟及精神負擔。但由于地中海貧血的不可治愈性，目前國際上針對地中海貧血的控制方案主要是控制地貧患兒的出生，提高新生人口的質量。根據調查統計顯示，地中海貧血在中國南方地區流行，廣東、廣西、重慶等地區地中海貧血分布廣泛，基因攜帶率高，分別為11.07%、23.98%［3］、13.96%［4］。同時在對新生兒臍帶血進行產前診斷的研究中發現，利用血紅蛋白電泳進行地貧篩查，其對地貧患者的陽性檢出率可達11.89%，但其對β-地貧篩查效果明顯低于α-地貧，這就很容易導致β-地貧患兒的漏診［5］。同時趙芳等［6］在廣東地區胎兒的基因型及血液學研究中表明，β-地貧患兒在胎兒期血象表現隱匿，血液學指標與正常對照組差異無統計學意義，所以這也可能導致β-地貧的漏診，錯過對病情進行干預的最佳時機。所以產前篩查在減少地貧患者的出生以及篩查β-地貧患者有著十分重要的作用。

本研究中，152例進行地貧篩查的病例中，共有55例確證為地中海貧血，其中檢出α-地貧35例，基因型為SEA缺失雜合子占27例，檢出 β-地貧19例，檢出α-地貧的陽性率高于β-地貧的陽性率，符合廣東地區地貧的發生分布情況，與索明環等［1］、李文瑞等［7］的結果相符，但地貧陽性符合率明顯低于李文瑞的關于東莞地區電泳結果的研究。在表2中，我們可以看到152例地貧篩查中，篩查陽性例數為74例，確診率為54.1%，明顯低于李文瑞的α-地貧基因符合率（α-地貧的基因符合率為80.55%，β-地貧的基因符合率為96.77%），這可能與我們儀器的結果判讀規則有關。本實驗室采用的是血紅蛋白毛細管電泳法，采用標本為全血，通過裂解紅細胞，再對其血紅蛋白進行電泳，檢測結果除所需血紅蛋白帶，還存在很多雜帶，這些雜帶會對檢測的電泳圖造成一定的影響，一般顯示存在很多不必要的雜交帶，甚至出現A2帶偏移的情況。這時需要人工對條帶進行修整，人為誤差存在很大因素，對于一些輕微的異常條帶容易忽略，也容易對正常區帶判斷存在輕微誤差而判定為電泳結果異常，導致出現漏診或誤診情況，使電泳試驗準確度下降，準確率為46.1%；在152例樣本中，有部分患者的血紅蛋白A2帶處于2.50%～2.55%，根據本實驗室儀器出現過整批次標本血紅蛋白帶偏低的情況，故人工判讀時仍會根據儀器情況將其判定為血紅蛋白A2偏低。所以在臨床的地貧篩查中，不能僅關注血紅蛋白電泳結果，需結合血細胞分析結果進行分析。

但作為分離和定量血紅蛋白的一種臨床常用方法，血紅蛋白電泳儀能檢出和確認各種正常和異常的血紅蛋白，診斷異常血紅蛋白病中有重要診斷意義；毛細管電泳作為一種新的血紅蛋白電泳技術，相對于瓊脂糖凝膠電泳、醋酸纖維薄膜電泳，更能準確區分HbA、HbA2、HbF、HbH、HbBart′s、HbCS等條帶，在地貧篩查中效果更佳［8］。在152例患者，異常血紅蛋白確診的符合率達80%，說明毛細管電泳對于異常血紅蛋白病的檢出有很高的臨床價值。在對152例患者進行電泳試驗，對比其基因診斷結果可知，其實驗靈敏度達85.5%，陰性預測值達71.2%；但實驗的特異性僅為23.7%，試驗準確度為46.1%，陽性預測值為38.8%，所以電泳異常在篩查地中海貧血患者與非地貧患者中具有一定的診斷價值，但其特異性低，假陽性率高，容易造成患者的不必要心理和經濟負擔。其中在表1中可以看出，血紅蛋白A2帶在正常人與α-地貧患者中無明顯差異，在正常人與β-地貧患者中差異具有統計學意義，說明當患者為β-地貧患者時，其血紅蛋白結果升高更具有臨床意義；但其他疾病如缺鐵性貧血等同樣可出現MCV、HBA2降低，所以α-地貧的試驗特異性不高，與非地貧組結果無明顯差異；同時由于α-地貧在廣東地區中數量較多，當患者為輕型或隱匿性α-地貧時，其血液學指標和血紅蛋白A2帶均可能表現為正常而導致這部分患者漏診，從而使準確度下降。根據毛細管電泳靈敏度高的特點，可以把大部分的疑似患者篩選出來，但實驗的特異性不高，導致試驗的假陽性率也相對較高，許多患者繼而進行基因檢測，容易增加患者的負擔。在表2中，有1例患者篩查結果為疑似β-地貧，基因檢測結果為α-地貧合并β-地貧，這可能是由于 α-肽鏈和β-肽鏈相對不平衡，比單一的α-肽鏈或β-肽鏈的貧血程度有所減輕，從而其典型血象和電泳結果表現為β-地貧，α-地貧表現不明顯，從而引起漏診。這也是毛細管電泳的一個暫時無法解決的缺點。

除了血紅蛋白含量檢測，地貧作為一種小細胞低色素性貧血，血液學表型變化是地貧患者或者地貧基因攜帶者的一個顯著特征，根據病情嚴重程度，典型地貧患者其血液學指標異于正常值，典型血象表現為，RBC升高、MCV、MCH降低，同時可伴有其他血液型指標變化。在表1中，根據基因診斷結果分成地貧組與非地貧組，對其進行統計學分析可發現，地貧組HB、MCV、MCH水平明顯低于非地貧組，RBC水平明顯高于非地貧組，HCT在兩組中無顯著性差異，說明地貧患者RBC、HB、MCV、MCH水平異于正常人；同時，分別將α-地貧、β-地貧與非地貧組進行比較，可知α-地貧的RBC水平高于非地貧組、MCV水平低于于非地貧組，差異有統計學意義；β-地貧的HB、MCV、MCH水平低于非地貧組，RBC、HbA2水平高于非地貧組，說明血液學指標在兩種地貧中的作用不盡相同。為了探究幾項血液學指標在地貧篩查作用的差異程度，我們采用受試者工作曲線對152例病例進行曲線下面積計算，探究各個指標的診斷效能及其切值。由表4中可以看出，HCT的曲線下面積僅為0.519，相應靈敏度、特異性為0.436、0.753，試驗的診斷效能較低；Hb的曲線下面積為0.616，相應靈敏度、特異性分別為0.673、0.577，試驗的診斷效能一般；MCV、MCH、RBC的曲線下面積分別是0.838、0.727、0.809，診斷效能較好，其中MCH靈敏度最高，MCV的特異性最高，均優于RBC。綜合表1、表4分析，MCV、MCH在地貧篩查中的診斷意義最高，所以臨床上懷疑地貧時更應留意其MCV、MCH兩個血液學指標。地貧組與非地貧組比較，MCV、MCH這兩個指標差異均存在統計學意義，其均值明顯低于正常值，這時可以通過檢測MCV、MCH的值來預測患者為地中海貧血。同時這兩個指標的約登指數最大時的切值均明顯低于標準參考范圍，所以實驗室可以通過各自實驗室的情況來制定適宜的診斷標準。

在表5中，以患者的MCV、MCH指標是否異常作為血細胞分析是否異常的標準，與基因結果進行比對可以發現實驗的靈敏度為87.3%、陰性預測值為87.9%，對于排除非地中海貧血患者具有一定診斷價值，但試驗準確度為65.1%、特異性為52.6%、陽性預測值為51.1%，確診地中海貧血的診斷價值不高，這是可能因為地中海貧血患者表現為珠蛋白肽鏈生成障礙造成血紅蛋白生成障礙，表現出RBC升高、MCV、MCH降低的典型血象，同時還可能存在機體對血紅蛋白生成障礙進行代償，表現為紅細胞代償性增多，紅細胞計數增加；當機體失代償時，機體紅細胞無法供應正常生理需求，表現為紅細胞計數下降［9］。當患者為缺鐵性貧血等其他病理性原因導致的貧血時，其血細胞分析結果也可能出現HB、MCV等指標降低，所以試驗的特異性不高，需要與其他病理性貧血性疾病進行區分。這時可以對患者進行血清鐵試驗或檢測RDW-CV值，以排除缺鐵性貧血等疾病的干擾，可以提高非地貧患者的排除率和地貧患者的檢出率。但對于臨床要完全排除缺鐵性貧血、自身免疫性溶血、其他血紅蛋白生成障礙性疾病等疾病仍存在一定的困難，所以單純依靠血細胞分析結果來判斷地中海貧血患者仍存在很大缺點。

對于診斷地貧患者，進行珠蛋白基因分析與蛋白質一級結構的分析，檢出氨基酸變異的性質及位置是一種理想的診斷方法，所以基因診斷可作為檢測地中海貧血的金指標，但因技術要求高未能廣泛開展應用［10］?！稄V東省衛生產前診斷技術管理實施細則》中明確了地貧產前診斷技術規范，包括了血細胞分析、血紅蛋白分析和基因診斷，血細胞分析用于初篩，進一步進行血紅蛋白電泳，結果異常這才進行基因診斷以便確診。但臨床上各個醫院及機構的篩查手段不盡相同，分析單純電泳篩查與聯合篩查對地貧分型的價值，探究兩種篩查手段在我院實驗室中的篩選價值有利于我院更好地開展地貧篩查工作。由表8中可見MCV、HbA2在α-地貧與β-地貧中無明顯差異，MCH在α-地貧與β-地貧中有顯著性差異；MCV、MCH、HbA2均異常與單純MCH在α-地貧、總地貧中有顯著性差異，在β-地貧中無明顯差異，所以臨床上診斷β-地貧時可主要分析電泳結果，但診斷α-地貧時則需要結合電泳和血細胞分析結果，才能更好地提示地貧篩選的結果。所以臨床上主要篩查手段為聯合分析血細胞分析結果與電泳結果，篩查結果陽性或可疑者再建議基因檢測，來達到地貧篩查的目標。

對比表5、表6、表7、表8，靈敏度最好的篩查手段為以血細胞分析聯合毛細管電泳結果任一異常均判為篩查異常，試驗的靈敏度可達到96.4%，陰性預測值為81.8%，可以將大多數的疑似地貧患者與健康人群篩選出來，但這種篩查手段的特異性低，導致相應的假陽性率增高。特異性最高的篩查手段為血細胞分析聯合毛細管電泳均異常判為篩查異常，其試驗的特異性為65.0%，可以有效地排除非地貧人群，同時其試驗靈敏度為72.7%，試驗準確度為67.8%（為四種篩查手段中最高），靈敏度、特異性、準確度均較高，所以以血細胞分析聯合毛細管電泳均異常作為篩查標準時，其在地貧篩查中的診斷效能最好，可以有效地降低漏診率，提高陽性檢出率。但當臨床需要為排除健康人群時，則采用靈敏度最高的診斷標準，可以有效地降低假陰性率。

血紅蛋白電泳和血細胞分析作為地中海貧血的篩查手段，兩種檢測均可以在一般的醫院中開展，所以，以血紅蛋白電泳聯合血細胞分析檢測作為地中海貧血的篩查手段，可以有效地檢出大部分的地中海貧血患者。但是隨著靈敏度升高、相應的特異性會降低，出現更多的非特異性反應而出現診斷陽性率降低。所以從患者本身情況出發，當需要減少漏診率時，應選擇實驗靈敏度更高的診斷方法，選擇電泳檢測與血細胞參數檢測，當出現異常時即進行基因檢測，可以減少漏診率。當患者存在經濟原因時，則先進行血細胞分析，當出現異常時再進行電泳檢測，結合檢測結果再決定是否進行基因檢測。