血清miR-145、miR-29聯合miR-217檢測在膀胱癌的表達差異及價值分析

邱厚兵，王春燕，彭 胡，楊清明

（瀘州市中醫醫院檢驗科，四川 瀘州646000）

膀胱癌是指發生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，占我國泌尿生殖系腫瘤發病率的第一位［1］。2012年中國惡性腫瘤發病和死亡分析顯示膀胱癌的發病率約為6.61／10萬，列惡性腫瘤發病率的第9位［2］。膀胱癌的發病率隨年齡增長而不斷增加，高發年齡50～70歲［2］。目前膀胱癌的診斷主要依據膀胱鏡，但該操作為有創性檢查，給病人造成較大的痛苦，不宜在人群中普及；此外，患者多因無痛性肉眼血尿這一癥狀就診時被發現，嚴重影響患者預后。故而，尋找有效、可靠的生物學標志物無疑可為膀胱癌的治療贏得時間，對提高患者生存率，改善其生存質量具有重要意義。微小RNA（microRNA，miR）是一類長度約為22核苷酸的非編碼RNA，其與腫瘤的發生、發展及轉移密切相關［3-4］。近年來研究發現多種miR在膀胱癌患者體內存在異常表達，且與癌細胞增殖、侵襲與轉移等密切相關［5-6］。本研究通過比較分析膀胱癌、膀胱炎患者及健康對照血清miR-145、miR-29聯合miR-217水平差異，分析三者與膀胱癌臨床病理特征之間的關系及對膀胱癌的鑒別診斷價值。

材料和方法

1 研究對象的納入

本研究經醫院倫理委員會批準。選取2016年2月至2018年5月在我院經穿刺或術中病理切片確診的膀胱癌患者80例，其中Ⅰ～Ⅱ期患者51例，Ⅲ～Ⅳ期患者29例；發生淋巴結轉移26例，未發生淋巴結轉移54例。膀胱癌的診斷及臨床分期依據美國國立綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）2016年第2版指南［7］。同期收取80例膀胱炎患者和80例我院健康體檢者。膀胱炎的診斷依據《尿路感染診斷與治療中國專家共識（2015版）》［8］。納入標準：①意識清楚，能正常進行溝通；②自愿參與本研究并簽署知情同意書；③未經手術及放化療治療。排除標準：①既往有其他腫瘤疾病史者；②排除有癲癇史或精神病患者；③患者或患者家屬不愿意參與者。

2 基本資料采集與血清miR-145、miR-29、miR-217檢測

由專業研究人員記錄所有研究對象年齡、性別、體質指數（body mass index，BMI）、吸煙史、飲酒史等基本信息。三組間在年齡、性別、BMI、吸煙史及飲酒史的差異均無統計學意義（P＞0.05），表明三組間具有可比性，見表1。

使用促凝采血管收集經禁食10 h以上膀胱癌和膀胱炎患者接受治療前和健康對照者入院體檢時的外周靜脈血5mL。收集的標本在1 h內于4℃條件下以3500g離心力（離心半徑為10cm）離心10min，收集上層血清。

血清RNA的提?。喊凑昭錜NA提取試劑盒說明書步驟進行總血清RNA提取。取上述提取的RNA，使用去除基因組反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，進行實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，RT-PCR）檢測。RT-PCR按照SYBR GREEN說明書進行，反應體系為：Mix 10μL，上下游引物各0.8μL，cDNA 2μL，DEPC水6.4μL。循環條件：95℃變性5min；95℃30s，63℃30s，72℃30s，40個循環。應用PrimerPremier5.0進行PCR引物設計，引物合成由北京賽百盛基因技術有限公司提供，序列如下：miR-145上游引物：5’-AGTGTGTCATTCCC AGT-3’，下游引物：5’-TGGAACCAGCTGCATT-3’；miR-29上游引物：5’-TACAACCCACTACCTG-3’，下游引物：5’-TGGAATGCAGGCTGCT-3’；miR-217上游引物：5’-CGAACGACCGAAG-3’，下游引物：5’-GCCAAGTTAGATAAGC-3’；內參基因U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。采用2-ΔCt法計算miR的相對表達量，△Ct值＝樣本Ct值-U6 Ct值。血清miR-145、miR-29、miR-217和U6基因熔解曲線峰型單一，說明引物沒有形成引物二聚體，見圖1。

表1 三組間臨床資料比較

圖1 miR-145、miR-29、miR-217和U6基因熔解曲線峰型

3 統計學處理

應用SPSS 19.0軟件進行分析。正態分布數據資料采用均值±標準差（）表示，兩組間和多組間比較分別采用t檢驗和方差分析。率的比較采用卡方檢驗。相關性分析采用Spearman檢驗。受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC）分析計算血清miR-145、miR-29、miR-217水平判別膀胱癌的曲線下面積（area under ROC curve，AUC）。將本研究人群分為膀胱癌與非膀胱癌（膀胱炎組及健康組）兩組，自變量為年齡、性別、吸煙、飲酒、BMI、miR-145、miR-29和miR-217水平等因素，因變量為是否發生膀胱癌，采用二元Logistic回歸，應用Wald向前法分析并計算miR-145、miR-29和miR-217水平預測膀胱癌發病風險的比值比（odds ratio，OR）。本實驗的檢驗水準為 α＝0.05，P小于0.05表示差異具有統計學意義。

結 果

1 三組間血清miR-145、miR-29和miR-217水平比較

膀胱癌患者血清miR-145、miR-29和miR-217表達水平（檢測結果經負對數轉換后呈正態分布）顯著低于膀胱炎患者和健康對照者（P＜0.05），而膀胱炎患者和健康對照者間血清miR-145、miR-29和miR-217水平差異均無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 三組間血清miR-145、miR-29和miR-217水平比較

2 血清miR-145、miR-29和miR-217與膀胱癌臨床特征的關系

如表3所示，血清miR-145、miR-29和miR-217表達水平與膀胱癌患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史和BMI等因素均無明顯關系（P＞0.05），而與膀胱癌淋巴結轉移（miR-145：r＝-0.514，P＝0.006；miR-29：r＝-0.465，P＝0.020；miR-217：r＝-0.487，P＝0.023）及TNM分級（miR-145：r＝-0.501，P＝0.016；miR-29：r＝-0.449，P＝0.003；miR-217：r＝-0.509，P＝0.007）呈線性關聯。

表3 血清miR-145、miR-29和miR-217與膀胱癌臨床特征的關系

3 血清miR-145、miR-29和miR-217對膀胱癌的鑒別價值

ROC曲線分析顯示，血清miR-145、miR-29和miR-217在區分膀胱癌與膀胱炎患者和健康對照的AUC分別為0.825（95%CI：0.732～0.918，P＜0.001）、0.889（95%CI：0.764～0.947，P＜0.001）和0.752（95%CI：0.658～0.826，P＜0.001）；對應的靈敏度／特 異 性 分 別 為：81.3%／82.9%、82.7%／89.7%和77.2%／83.3%；診斷界值分別為12.4（-log）、34.2（-log）和24.6（-log），見圖2A。聯合血清miR-145、miR-29和miR-217在區分膀胱癌與膀胱炎患者和健康對照的AUC為0.937（95%CI：0.894～0.977，P＜0.001），靈敏度91.7%，特異性84.7%，見圖2B。

圖2 血清miR-145、miR-29和miR-217對膀胱癌鑒別價值

4 血清miR-145、miR-29和miR-217水平對膀胱癌的風險評估

將本研究人群分為膀胱癌與非膀胱癌（膀胱炎組及健康組）兩組，自變量為年齡、性別、吸煙、飲酒、BMI、miR-145、miR-29和miR-217水平等因素，因變量為是否發生膀胱癌。二元Logistic回歸分析結果，見表4。單因素分析顯示，血清低miR-145、低miR-29和低miR-217是膀胱癌的危險因素；多因素分析顯示，在校正了年齡、性別、吸煙、飲酒、BMI后，血清低miR-145、低miR-29和低miR-217是膀胱癌的獨立危險因素。

表4 血清miR-145、miR-29和miR-217水平對膀胱癌的風險評估

討 論

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤，也是全身十大常見腫瘤之一。生物標志物是血液、尿液或者組織中能檢測疾病狀態的分子指標，可用于疾病的檢測［9-10］。理想的生物標志物應具有較高的靈敏度和特異性，且在非腫瘤患者體液中其水平不會增高。

miR是近年生物標志物領域的研究熱點，其作為基因調控因子能在轉錄后水平抑制靶基因的表達或蛋白質翻譯，已被證實在多種腫瘤中存在異常表達。miR-145、miR-29和miR-217是近年研究發現的可能在膀胱癌發展中起重要作用的三個抑癌基因。MINAMI等［11］觀察到上調miR-145后可顯著下調下游促癌靶基因Krüppel樣因子4的表達，進而降低膀胱癌T24細胞系的增殖與遷移能力，并促進癌細胞凋亡。EKMAN等［12］運用基因芯片對兔子膀胱癌模型篩查發現，與健康兔子相比，膀胱癌模型兔子組織中miR-29表達顯著降低。而HUANG等［13］發現環狀RNA hsa_circ_0000144可抑制miR-217表達，進而通過抑制miR-217下游抑癌基因RUNX2促進膀胱癌的發生發展。雖然關于miR-145、miR-29和miR-217在膀胱癌相關細胞學和動物模型等機制研究已有報道，但關于三者在膀胱癌患者中的表達差異及臨床價值分析仍未見報道。

本研究我們通過臨床樣本血清中的檢測發現，膀胱癌患者血清miR-145、miR-29和miR-217水平顯著低于膀胱炎患者和健康對照，miR-145、miR-29和miR-217三者對膀胱癌發生發展有抑制作用，而其在膀胱癌患者血清中表達水平的降低也與前期多個機制研究結果相互呼應，進一步證實三者是膀胱癌重要的抑癌基因［11-13］。進一步分析發現，低miR-145、低miR-29和低miR-217水平與膀胱癌患者發生淋巴結轉移和TNM分級相關，且發生淋巴結轉移和處于Ⅲ～Ⅳ期患者的血清miR-145、miR-29和miR-217水平降低最顯著，前期多個學者在細胞學和動物體內研究均發現miR-145、miR-29和miR-217可通過靶向干預多個下游通路分子如Krüppel樣因子4、RUNX2等參與抑制膀胱癌的侵襲與轉移，減緩癌癥進展，這也解釋了患者血清中miR-145、miR-29和miR-217水平在淋巴結轉移及Ⅲ～Ⅳ期時顯著低于未發生淋巴結轉移和Ⅰ～Ⅱ患者［11，13］，表明血清低miR-145、低miR-29和低miR-217與膀胱癌的發生發展關系密切，且三者水平對患者疾病進展具有一定的預警價值。ROC曲線分析顯示，血清miR-145、miR-29和miR-217在區分膀胱癌與膀胱炎患者和健康對照的靈敏度／特異性分別為81.3%／82.9%、82.7%／89.7%和77.2%／83.3%；而聯合三者后在區分膀胱癌與膀胱炎患者和健康對照的靈敏度顯著提高，達到91.7%，提示聯合血清miR-145、miR-29和miR-217具有較高的診斷價值。進一步二元Logistic回歸分析顯示，在校正了年齡、性別、BMI、吸煙、飲酒后，血清低miR-145、低miR-29和低miR-217是膀胱癌的獨立危險因素。證實了血清miR-145、miR-29和miR-217水平差異可作為膀胱癌的診斷指標。然而，本研究仍有如下不足值得注意：①由于納入的人群均來自我院，上述三項miR指標在我國其他地區膀胱癌患者中是否仍存在表達差異有待進一步多中心的隊列研究來驗證；②本研究納入80例膀胱癌患者，對于本次研究結果的解讀仍需慎重，需要今后更大樣本量的研究來證實。

綜上，通過本次實驗我們發現血清miR-145、miR-29和miR-217的表達差異在膀胱癌中的診斷價值以及在評估膀胱癌患者發生腫瘤遠處轉移中均具有重要的臨床意義，有望為膀胱癌患者的診療及預后改善提供新的途徑與思路。