血清miR-1聯合cTn I、TNF-α對病毒性心肌炎診斷及預后評估的價值分析

霍明艷，張 娜，胡 娜，孫 立，王 虹

（承德醫學院附屬醫院心臟內科，河北 承德067000）

病毒性心肌炎以心肌出現局限性或彌漫性炎癥反應為特征，侵襲力強，可誘發心肌損傷甚至導致患者出現嚴重心律失常、心力衰竭或猝死［1］。病毒性心肌炎患者在感染早期癥狀多不明顯，當心肌細胞出現受損時可見心肌損傷標志物出現波動。然而，常用心肌損傷標志物半衰期較短，水平波動快，峰值出現時間不一等問題。目前，病毒性心肌炎的確診依靠心肌活檢，但該檢查為侵入式，具有創傷性。理想的生物學標志物可在疾病鑒別診斷和預后評估中發揮重要作用，一直是研究的熱點。近年發現，微小核糖核酸-1（microRNA-1，miR-1）與心肌損傷相關疾病如心肌梗死、心衰和心肌炎等的進展關系密切［2-3］。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是重要的炎癥因子，前期動物模型證實TNF-α在病毒性心肌炎中可以異常表達［4］。本研究擬通過聯合血清miR-1、TNF-α和肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTn I）三項分析對病毒性心肌炎診斷及預后的價值。

材料和方法

1 研究對象納入

依據我國制定的成人病毒性心肌炎診斷標準［5］，收集2011年9月至2013年8月我院病毒性心肌炎患者86例，其中男性65例，女性21例；年齡范圍25～53歲，平均年齡36.3±3.6歲。收取心肌梗死患者80例，其中男性58例，女性22例；年齡范圍29～56歲，平均年齡39.2±4.0歲。同期收取健康對照100例，其中男性73例，女性27例；年齡范圍26～55歲，平均年齡37.7±3.9歲。納入標準：①年齡在25～60歲間；②意識清楚，語言表達能力正常，能與調查人員進行正常的溝通；③進行研究目的溝通后，研究對象自愿參與本研究；④簽署知情同意書。排除標準：①有自身免疫性疾病史者（如類風濕關節炎、皮肌炎、橋本氏甲狀腺炎、甲狀腺機能亢進等）；②近期有急慢性細菌、病毒等感染者；③已接受手術或免疫治療者；④基本信息無法采集或精神分裂癥患者無法配合者；⑤未簽署知情同意書者。項目經醫院倫理委員會批準。

2 樣本的采集與前處理

使用含促凝劑采血管抽取病毒性心肌炎患者治療前及健康對照外周靜脈血5ml，于1 h內4℃條件下以3000g離心力離心15min，收集上層血清進行相關指標檢測。取500μL血清按照RNA提取試劑盒步驟進行總RNA提取，后經反轉錄試劑盒進行反轉錄，保存于-80℃中待測。

3 血清miR-1、TNF-α和cTn I檢測

應用RT-PCR（美國Bio-Rad公司C1000型）對miR-1進行相對定量。條件為：95℃變性5min；95℃30s，56℃30s，72℃30s，42循環。內參選擇甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）。設計miR-1與GAPDH引物序列為：miR-1上游：5’-ACTCCATGTCATCGACC AGT-3’，下 游：5’-TGCGTAGGCGATGTCT-3’；GAPDH上 游：5’-GGTTCAAATCGAGTCAT-3’，下游：5’-GAGTCCCGGATCATAAGAA-3’。圖1可見，miR-1和GAPDH擴增及熔解曲線峰型單一，未見非特異性擴增。采用2-ΔCt法計算各基因的相對表達量。

采用酶聯免疫吸附試驗檢測TNF-α水平，采用化學發光法檢測cTn I水平，檢測試劑盒分別由美國R＆D Systems公司和上海超研生物科技有限公司提供。

圖1 miR-1和GAPDH擴增和熔解曲線

4 隨訪內容

每隔3個月門診隨訪一次，行心電圖、超聲心動圖檢查以判定病情轉歸，共進行60個月的隨訪。病毒性心肌炎病情轉歸標準為［5］：①臨床痊愈：無癥狀，各項檢查未見異常；②恢復遷延：患者僅有輕度自覺癥狀、心電圖、超聲心動圖輕度改變；③心律失常：60個月內表現為穩定的心電圖異常，如早搏、傳導阻滯、竇速等；④擴張型心肌?。喊l生進展性心功能不全伴全心擴大，以收縮功能不全為主，心電圖顯示心律失常；⑤患者死亡。

5 統計學處理

應用SPSS 20.0軟件分析。計量資料以均值±標準差（）表示，多組間比較用方差分析，兩組間比較用t檢驗。率的比較用卡方檢驗或Fisher確切概率法。相關性分析用斯皮爾曼檢驗。ROC曲線計算血清miR-1、TNF-α和cTn I的診斷價值。檢驗水準 α＝0.05。

結 果

1 三組間臨床資料比較

如表1所示，三組間的年齡和性別差異無統計學意義（P＞0.05）。單因素方差分析顯示三組間白細胞、嗜酸性粒細胞和超敏C反應蛋白的差異有統計學意思（P＜0.05）。與健康對照相比，病毒性心肌炎和心肌梗死患者白細胞、嗜酸性粒細胞和超敏C反應蛋白顯著高于健康對照（P＜0.05），而病毒性心肌炎和心肌梗死患者白細胞、嗜酸性粒細胞和超敏C反應蛋白水平差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 三組間臨床資料比較（）

表1 三組間臨床資料比較（）

注：與健康對照相比，*P＜0.05

項目 病毒性心肌炎（n＝86） 心肌梗死（n＝80） 健康對照（n＝100） 統計值 P值年齡（歲） 36.32±3.61 39.16±3.95 37.65±3.87 F＝1.428 0.372男性（%） 65（75.58） 58（72.50） 73（73.00） χ2＝0.242 0.886白細胞（109／L） 14.71±2.22* 14.93±2.41* 7.64±1.27 F＝4.809 0.013嗜酸性粒細胞（%） 14.14±1.72* 13.34±1.50* 2.11±0.23 F＝13.763 ＜0.001超敏C反應蛋白（mg／L） 48.23±9.25* 44.13±7.90* 1.92±0.39 F＝48.552 ＜0.001

2 三組間血清miR-1、TNF-α和cTn I水平比較

單因素方差分析顯示三組間血清miR-1、TNF-α和cTn I水平差異有統計學意義（P＜0.05）。與健康對照和心肌梗死相比，病毒性心肌炎患者血清miR-1和TNF-α顯著增高（P＜0.05），心肌梗死患者血清TNF-α和cTn I顯著高于健康對照（P＜0.05），而健康對照和心肌梗死血清miR-1差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 三組間血清miR-1、TNF-α和cTn I水平比較（）

表2 三組間血清miR-1、TNF-α和cTn I水平比較（）

注：與病毒性心肌炎相比，*P＜0.05；與心肌梗死相比，＃P＜0.05

＜0.001 ＜0.001 ＜0.001病毒性心肌炎（n＝86） 31.61±2.12 122.62±7.14 1.41±0.13心肌梗死（n＝80） 15.16±1.67* 82.15±6.15* 1.72±0.18健康對照（n＝100） 14.14±1.33* 57.84±5.22*＃ 0.12±0.02*＃F值 6.265 8.432 4.918 P值組別 miR-1（-log） TNF-α（ng／L） cTn I（μg／L）

3 血清miR-1、TNF-α和cTn I水平與病毒性心肌炎臨床轉歸

60個月隨訪中，臨床痊愈者50人；恢復遷延者17人；心律失常者13人；并發擴張型心肌病者6人；死亡者0人。以miR-1、TNF-α和cTn I的中位數（miR-1：28.86；TNF-α：116.46 ng／L；cTn I：1.32μg／L）分別將患者分為高、低水平組。相比于低miR-1、TNF-α和cTn I水平組，高miR-1、TNF-α和cTn I水平組的臨床痊愈率與恢復遷延率均明顯降低，而心律失常與擴張型心肌病的發生率均顯著增高（P＜0.05）。而高、低miR-1、TNF-α和cTn I組間白細胞、嗜酸性粒細胞和超敏C反應蛋白水平差異均無統計學意義（P＞0.05），見表3。斯皮爾曼相關性分析顯示，血清miR-1、TNF-α和cTn I水平與病毒性心肌炎患者臨床痊愈、恢復遷延、心律失常和擴張型心肌病發生均具有顯著相關性（P＜0.05），而與白細胞、嗜酸性粒細胞和超敏C反應蛋白無相關性（P＞0.05），見表4。

表3 血清miR-1、TNF-α和cTn I水平與臨床轉歸

表4 血清miR-1、TNF-α和cTn I水平與臨床轉歸相關性分析

4 血清miR-1、TNF-α和cTn I對病毒性心肌炎診斷價值分析

ROC曲線分析顯示，血清miR-1、TNF-α和cTn I在區分病毒性心肌炎和健康人群的AUC分別為：0.902（95%CI：0.841～0.964，P＜0.001）、0.789（95%CI：0.704～0.875，P＜0.001）和0.685（95%CI：0.594～0.778，P＜0.001），尤登指數最大時對應的靈敏度／特異性分別為：80.2%／98.9%、79.1%／87.4%和68.8%／61.4%；診斷界值分別為：26.78（-log）、88.42 ng／L和0.28μg／L。聯合血清miR-1、TNF-α和cTn I在區分病毒性心肌炎和健康人群的AUC為0.932（95%CI：0.879～0.985，P＜0.001），靈敏度90.2%，特異性91.7%，見圖2。

圖2 血清miR-1、TNF-α和cTn I對病毒性心肌炎診斷價值分析

討 論

病毒性心肌炎患者預后差異性較大，報道顯示，約50%病毒性心肌炎患者可痊愈，而約20%的患者可遺留不同程度的心臟器質性病變［6］。目前，尋找早期無創篩查與預后評估標志物是病毒性心肌炎的研究熱點［7］。

cTn I是心肌細胞特異標志物，其在心肌細胞受損早期即可出現升高，并在反映病毒性心肌炎時心肌細胞損傷具有重要價值。張榮欣［8］對52例病毒性心肌炎血清CK-MB、cTnⅠ與CRP進行檢測發現，單獨應用cTnⅠ對病毒性心肌炎的靈敏度為65.38%，而在聯合三項指標時，靈敏度提高至90.38%，提示聯合檢測可提高陽性檢出率。本研究我們發現病毒性心肌炎患者血清cTnⅠ顯著增高，單獨應用cTnⅠ鑒別診斷病毒性心肌炎的靈敏度／特異性為68.8%／61.4%，和早前國內報道的結果相符［8］，當聯合miR-1、TNF-α和cTn I時較單獨應用各指標時的靈敏度提高近10%，達到90.2%，提示聯合應用上述三項指標對提高診斷靈敏度具有一定價值，但值得注意的是在聯合三個指標后，曲線下面積較單獨應用miR-1時僅提高了0.02，由于聯合檢測會使得檢測成本增高，對于聯合檢測仍需綜合考慮。近年來，越來越多的證據表明miR-1和心血管疾病如卒中等關系密切［9-10］。研究發現miR-1在缺血性腦卒中病變模型中發揮作用，在缺血性腦卒中小鼠模型中檢測到miR-1的水平較健康對照小鼠顯著增高，且miR-1的水平與小鼠神經元的死亡呈正相關［9］。進一步的研究證實，miR-1可以通過調節細胞內p53的水平發揮細胞毒性功能，進而增加小鼠對活性氧（reactive oxygen species，ROS）等氧化應激物質的易感性，加速神經細胞死亡［10］。心肌細胞炎癥反應是病毒性心肌炎的病理基礎，早前小鼠實驗發現，上調miR-1水平可抑制小鼠間隙連接蛋白43（connexin-43，Cx43）表達，促進心肌炎癥損傷，而早前研究已證實Cx43表達下調可降低細胞炎癥反應［11］，這些研究提示，miR-1在病毒性心肌炎時可出現高表達。然而，關于miR-1在病毒性心肌炎診斷及預后評估的研究尚未見報道。除cTnⅠ與miR-1外，TNF-α與病毒性心肌炎的相關性研究也取得了一定進展。TNF-α參與機體炎癥反應過程。阮妙華等［12］在對60只病毒性心肌炎小鼠模型的研究發現，與對照組小鼠比，感染組小鼠血清TNF-α及其下游產物基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2和MMP-9水平均顯著增高，而MMP家族蛋白是重要的炎癥反應因子。研究指出，TNF-α參與病毒性心肌炎的可能機制是誘導心肌細胞表面白細胞分化抗原（cluster of differentiation，CD）-1d表達，從而增加對柯薩奇病毒易感性［13］。

在本研究中，我們首次探究了聯合血清miR-1、TNF-α和cTn I三項指標對病毒性心肌炎的診斷與預后評估價值。研究結果表明，聯合檢測血清病毒性心肌炎可較好地區分病毒性心肌炎患者與健康人群，且三者的水平與病毒性心肌炎患者的臨床轉歸密切相關，高miR-1、TNF-α和cTn I水平提示不良預后。這些研究結果與前期國內外研究相呼應，表明聯合檢測血清miR-1、TNF-α和cTn I具有一定的推廣價值。然而，本研究尚存在研究例數不足、患者來源單一等缺點，有待后期大樣本、多中心的隊列研究進一步驗證。

綜上，本次研究發現聯合血清miR-1、TNF-α和cTn I在病毒性心肌炎診斷和預后情況評估有著較大應用價值。