基于網絡藥理學的有關苓桂術甘湯干預治療心力衰竭的作用機制

謝璇 王青 蘇聰平

摘要 目的：根據網絡藥理學方法尋找苓桂術甘湯治療心血管疾病的潛在靶點。方法：從在線的中醫藥生物信息學分析網站（BATMAN-TCM）篩查和預見苓桂術甘湯干預心力衰竭的可能的有效成分及其作用于心力衰竭的靶點。使用Cytoscape軟件建立苓桂術甘湯以及其中所含的單味藥針對心力衰竭的靶點-成分網絡圖。采取韋恩圖（Venny 2.1）進一步研究苓桂術甘湯中茯苓及甘草治療心力衰竭的機制。結果：我們從結果里發現苓桂術甘湯在治療心力衰竭方面有79個活性成分，有18個靶點與心力衰竭是相關的，且檢索到的靶點和有效成分有緊密的關系，找到的18個靶點主要是：ACE;ADRA2A;ADRA2B等。甘草在苓桂術甘湯中的靶點數最多，占全方治療心力衰竭總靶點數的94.4%。結論：苓桂術甘湯改善心力衰竭的機制可能與降低AngⅡ、抑制RAS的活性、調節交感神經系統等具有相關性，其中甘草在治療心力衰竭方面是苓桂術甘湯中最突出藥物。

關鍵詞 苓桂術甘湯;網絡藥理學;茯苓;甘草;心力衰竭;靶點

Abstract Objective：To explore the potential targets of Linggui Zhugan Decoction for the treatment of heart failure by using network pharmacology.Methods：A bioinformatics analysis website for traditional Chinese medicine（BATMAN-TCM）was used to predict and screen the possible active components of Linggui Zhugan Decoction in the intervention of heart failure and its targets for heart failure.The Cytoscape software was used to construct a target-component network for the treatment of heart failure with Linggui Zhugan Decoction and its single medicines.Venn diagram（Venny 2.1）was used to further study the mechanism of Poria and Radix et Rhizoma Glycyrrhizae of Linggui Zhugan Decoction in the treatment of heart failure.Results：A total of 79 active components in the Linggui Zhugan Decoction were screened out from the results.There were 18 targets associated with heart failure，and the active components and targets were closely related.The 18 targets obtained mainly included：ACE; ADRA2A; ADRA2B and so on.The target number of Radix et Rhizoma Glycyrrhizae in Linggui Zhugan Decoction was the largest that it accounted for 94.4% of the total targets of the decoction in the treatment for heart failure.Conclusion：The mechanism of Linggui Zhugan Decoction in improving heart failure may be related to the decrease of AngII，the inhibition of RAS activity，and the regulation of sympathetic nervous system，etc.Among which，Radix et Rhizoma Glycyrrhizae is the most prominent in the aspect of Linggui Zhugan Decoction in treating heart failure.

Key Words Linggui Zhugan Decoction; Network pharmacology; Poria; Radix et Rhizoma Glycyrrhizae; Heart failure; Target

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.05.011

苓桂術甘湯出自張仲景《金匱要略·痰飲咳嗽病脈證并治》：“心下有痰飲，胸脅支滿，目眩，苓桂術甘湯主之”?！胺蚨虤庥形?，當從小便去之，苓桂術甘湯主之;腎氣丸亦主之”。及《傷寒論》原文“傷寒若吐若下后，心下逆滿，氣上沖胸，起則頭眩，脈沉緊，發汗則動經，身為振振搖者，茯苓桂枝白術甘草湯主之”。該方具有溫陽化飲，健脾利濕之功效的臨床常用方劑。茯苓具有淡滲利濕的功效，可以驅遂飲邪自小便而出，因利而去，故為君藥。桂枝通陽化氣，使飲邪從汗而解，又兼有平沖降逆之功，故以為臣，與茯苓相配伍，一利一溫，對于寒性的水飲停滯者，有溫化滲利的優點。濕生于脾，脾虛則濕氣漸起，白術燥濕健脾，助脾運化，使脾陽盛而水濕自去，佐茯苓還可以消痰以除支滿。甘草補中，佐桂枝培育土氣以制水邪，四藥合用共奏飲去脾和，濕不復起之功效?？捎糜谥委熖碉嫴?，短氣，眩暈，心悸，胃口差，耳鳴，耳聾，美尼爾氏綜合征，心臟病中有心絞痛、水腫、喘咳、漏尿、各種神經官能癥、慢性腎小球腎炎等多種疾病。其在應用上加減化裁很靈活，治病范圍也很廣泛，臨床只要運用得當，效果非常好。

慢性心力衰竭（Chronic Heart Failure，CHF）指由多種情況所導致的心肌損傷造成心臟功能結構的該百年，致使充盈功能低下導致心室泵血以至射血量不足，達不到器官及組織代謝所需要的血量的一種復雜的臨床綜合征，是一種臨床多發病、常見病，是多種心血管疾病的最后結局。心力衰竭患者在尋求西醫的治療過程中會產生大量的金錢花費、療效確有可能不是十分顯著，并且由于經濟原因，一部分患者往往不能遵從醫生的指導用藥，私自的減藥，這對于疾病的治療是十分不利的，因此我們需要在中醫領域探尋治療心功能衰竭的方法，達到在臨床上愈發頻繁的運用中醫經典方劑的效果。自研究開始以來有許多關于苓桂術甘湯治療心血管疾病的結果，苓桂術甘湯也從一個簡單的經方轉變為臨床常用的治療高血壓、冠心病、心律失常、CHF等疾病方劑[1-7]。施慧等[8]運用苓桂術甘湯的含藥血清，在大鼠原代心肌細胞上用脂多糖來誘導并觀察IKK/IκB/NF-κB信號通路上相關蛋白表達，結果表明苓桂術甘湯通過對下游靶分子的轉錄進行干預，可以有效的調節IKK/IκB/NF-κB信號通路相關蛋白表達，進一步達到減弱細胞因子的過度激活的目的。此外，苓桂術甘湯能明顯降低CHF大鼠血清IL-1β、ET-1、TNF-α和AngⅡ水平，抑制大鼠心室重構，大大提高CHF大鼠心臟舒縮能力的作用，還能使采用多柔比星造模的心力衰竭大鼠的心臟功能，結果顯示苓桂術甘湯具有抗多柔比星所造成的心肌毒性作用，其機理可能是抑制脂肪酸氧化以及AMPK活化[9-10]。然而，中藥方劑中具有多種復雜的化學成分以及其治療疾病的多樣化，導致在心力衰竭方面苓桂術甘湯的具體作用原理目前還是不明朗，所以我們采用網絡藥理學的方式深入發掘苓桂術甘湯主要的活性成分以及所對應的作用靶點并通過Cytoscape軟件研究其與病種間的相關性，從而將苓桂術甘湯干預治療心力衰竭的作用機制完整的有條理的梳理出來，這對未來治療心力衰竭具有深遠意義[11]。

1 材料與方法

1.1 靶點及其相對的有效成分的預測挖掘 在BATMAN-TCM數據庫中尋找苓桂術甘湯治療心力衰竭的潛在靶點，進入BATMAN-TCM服務器（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm），分別輸入苓桂術甘湯主要靶點，取得分別的靶點相對的有效成分選擇的結果，應用得到的具體數據進行分析[12]。通過系統解讀疾病與靶點之間的關系連接，BATMAN-TCM可以針對活性成分與目的靶點之間的關聯性進行評判（Score）。應用統計分析方法，采用最優的衍算方法得到苓桂術甘湯治療疾病的有意義的P值。之后我們選擇苓桂術甘湯所治療的疾病種有統計學意義的。以P<0.05作為“通路-藥物”結構構建的基本要求。以Score cut off=20為基線，得到苓桂術甘湯治療心力衰竭的具有統計學意義的分析報告，以及其所對應的靶點，并且得到活性成分的結果。

1.2 有效成分和靶點的網絡構建與分析 根據得到的活性成分與可能的靶點，我們采用Cytoscape軟件，利用關聯功能（Merge）建立一個藥物-靶點網絡系統。在生成的網絡圖里，線代表化合物-靶點的相互作用，節點代表化合物和靶點。

1.3 茯苓與甘草靶點分析 苓桂術甘湯重用茯苓為君，甘草雖為佐使藥卻有不可替代的意義?！夺t宗金鑒》：“《靈樞》謂心胞絡之脈動則病胸脅支滿者，謂痰飲積于心胞，其病則必若是也。目眩者，痰飲阻其胸中之陽，不能布津于上也。茯苓淡滲，遂飲出下竅，因利而去，故用以為君。桂枝通陽輸水走皮毛，從汗而解，故以為臣。白術燥濕，佐茯苓消痰以除支滿。甘草補中，佐桂枝建土以制水邪也。在BATMAN-TCM中尋找君藥茯苓和佐使藥甘草治療心力衰竭的靶點。使用韋恩圖（Venn diagram）深入探索茯苓與甘草治療心力衰竭的不同作用機理。

2 結果

2.1 在BATMAN-TCM數據庫中，檢索苓桂術甘湯干預治療心力衰竭的靶點，發現苓桂術甘湯治療心力衰竭的靶點共18個，如表1所示，（其中治療心力衰竭靶點為14個，另外含有充血性心力衰竭靶點6個，ADRBK1;TNF為兩者共有靶點，）是苓桂術甘湯治療心力衰竭有效靶點，與心力衰竭的典型信號通路相一致（P<0.05）。

2.2 檢索苓桂術甘湯的有效成分 在BATMAN-TCM中我們檢索出苓桂術甘湯中共有178個化合物，茯苓含54種化合物、桂枝含32種化合物、白術含26種化合物、甘草含172種化合物。通過人工檢索得到79個苓桂術甘湯干預治療心力衰竭的靶點所對應的化合物。在表2中，若某些靶點對應的靶成分多于3個，則只寫出其對應的前3個成分，這里包括木質素、有機酸、生物堿、皂苷及萜類等（P<0.05）。而后，分別將18個心力衰竭靶點輸入單味藥檢索中，得到各個藥治療心力衰竭做出貢獻的相關成分，在表3中，若有某些靶點具有多于3個靶成分，則只列出排名前3的成分（P<0.05）。

2.3 活性成分-作用靶點的網絡模型的建立及解析采用Cytoscape軟件建立在衰竭方面，苓桂術甘湯中有效成分-作用靶點的網絡結構示意圖。在圖1中我們可以看出，在治療心力衰竭方面的18個潛在靶點分別對應79個活性成分，多種的有效的成分對應同一個的靶點，也可以對應不同的靶點，這全面展示出苓桂術甘湯在治療心力衰竭種的多靶點、多成分的作用原理。

2.4 茯苓與甘草靶點解析 利用韋恩圖（Venny 2.1）深入探索苓桂術甘湯中的君藥茯苓與佐使藥甘草在治療心力衰竭的機制方面的關系。結果表明，在治療心力衰竭上茯苓與甘草共有的靶點數量為4，占2藥全部靶點數的23.5%;茯苓獨有的靶點數為0，（其全部靶點為充血性心力衰竭靶點）;甘草獨有的靶點數為13（甘草的靶點中，心力衰竭靶點為14個，充血性心力衰竭靶點6個，ADRBK1;TNF為共有靶點），占總數的76.5%。

3 討論

現今研究中藥方劑主要采用的是固有的分離提取法，例如水提醇沉法、溶劑提取法、超臨界流體提取法、水蒸氣蒸餾法通過將其內涵的有用部位及活性成分汲取出來，或者研究其內含的某些單體藥物，以動物或細胞等實驗方法用來測試，以期得到治療疾病的活性成分組合，或研究某些活性部位的作用機理，再將其進行組合從而促進中藥新藥的再開發與利用[13]。通過大量的實驗研究我們得到了一些研究成果，但因時間花費大，且研究的結果可能與臨床實際有所出入，而中藥方劑具有成分多靶點多的特證使其在單一種類的研究方面不能很好的展示出中藥的優點，因此采用原來的方式得到的結果不能很好的展現出中藥方劑的療效[14]。結合網絡藥理學來深入挖掘中藥方劑的特征，根據中藥里的化學成分是明了的，疾病中的靶點也是清楚的前提下，多角度全方位的利用現代科技帶來的研究成果，并且使用在線工具繪制中藥方劑里化學成分的多靶點、多路徑的作用機制示意圖，并使有效成分與相關靶標及疾病的復雜分子作用機制可以直截了當的展示在世人面前。這種方法對中藥新藥的再開發再利用給予新的可能[15]。

文中用苓桂術甘湯為代表，利用在線的中醫藥生物信息學分析網站探索苓桂術甘湯治療心力衰竭的可能，并用得到的相關靶點進行深入挖掘，根據靶點與疾病可能存在的相關道路，推測苓桂術甘湯治療心力衰竭的可能機理，并且篩選了苓桂術甘湯中君藥茯苓與佐使藥甘草的治療心力衰竭的靶點。統計結果給我們展現出苓桂術甘湯治療慢性心力衰竭的作用機制靶點包括1型血管緊張素II受體、α2型腎上腺素受體、血管緊張素轉化酶等。眾多實驗表明，抑制腎素-血管緊張素系統活性、降低血管緊張素Ⅱ、全面阻滯交感神經系統是治療心力衰竭的關鍵的癥結[16-18]。由表3顯示，雖然檢索桂枝與白術時沒有顯示其具有抗心力衰竭的作用，但其中某些成分對苓桂術甘湯整體治療心力衰竭做出了貢獻，體現出方劑中君臣佐使的特性。通過分析君藥茯苓與佐使藥甘草的靶點我們發現，甘草在苓桂術甘湯治療心力衰竭的過程中擔任重要作用因素。有實驗研究表明，甘草在治療心力衰竭方面有特殊貢獻，以炙甘草湯——以甘草為君藥，聯合曲美他嗪可明顯提高慢性老年性心力衰竭合并竇性心動過緩患者的心臟舒縮功能，降低血漿NT-proBNP和H-FABP水平，改善心功能。而與麻黃附子細辛湯連用炙甘草湯可使竇性心動過緩的患者，更有效地活氣血、養心脈，使心率趨于穩定，提高治療總有效率[19-20]。體外實驗研究表明在心肌細胞內甘草次酸和甘草酸可以發揮作用使活性氧的含量下降，而甘草次酸和甘草酸是甘草治療心力衰竭的突出療效組成部分[21]。與桂枝和茯苓配伍可以達到增加藥理效果的治療的心血管疾病的功效，桂枝甘草湯可以有效保護采用冠脈結扎術造模的心力衰竭大鼠的心肌功能，其主要的作用機理為消滅氧自由基，抗脂質氧化，及下調TGF-β1、ICAM-1表達;通過分析心率、治療效果、中醫癥候積分、及心電圖，加味桂枝甘草龍骨牡蠣湯具有十分明顯的減輕心悸體征的療效，能大大減弱心悸癥狀，降低心肌缺血的情況;防己黃芪湯可增強心力衰竭所致水腫患者的心功能，提高24 h尿量，改善治療效果，且安全性好;真武湯合防己黃芪湯加減可以使CHF患者的心功能分級提升、改善心功能和心室重構、中醫證候方面產生顯著療效[22]。

通過對苓桂術甘湯相關靶點與化學成分的相互作用進行分析，或許可以發現中藥方劑在分子水平上的繁雜的作用原理，從網絡水平和分子水平研究經典方劑苓桂術甘湯治療心力衰竭的具體機理，為經方治療心力衰竭提供現代化的科學研究結果。通過網絡藥理學研究“藥物-疾病-基因-靶點”的互相影響，可從多維度展現中藥方劑的治療情況，可能對苓桂術甘湯的藥理作用靶點、篩選其中有效靶成分做出提示，結合文獻分析可明顯降低實驗強度，加速中藥科學化進程及對臨床應用經方做出重要提示[23-24]。

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（2018-12-12收稿 責任編輯：徐穎）