染色質可接近性在前列腺癌研究中的作用

尚芝群,陳宣蓉,田 昊,李常穎,牛遠杰

(天津醫科大學第二醫院泌尿外科,天津市泌尿外科研究所,天津 300211)

在對生命奧秘探索的歷程中,人們逐漸認識到真核生物的遺傳信息主要儲存在細胞核內且以染色質的形式存在。染色質主要由DNA與組蛋白組成[1]。先前的研究普遍認為解碼DNA攜帶的遺傳信息就可以解釋整個基因表達調控規律。隨著對組蛋白修飾研究的深入,人們認識到在基因表達的動態平衡調控中,組蛋白所處的修飾狀態,染色質的高級結構變化及染色質可接近程度的變化也發揮著重要作用[2-4]。因此,對前列腺癌遺傳規律的解碼,將從染色質層面揭示其發生變化規律,從而更深入的認識腫瘤的基因表達調控[5-7]。

1 染色質可接近性的定義

基因的表達調控瞬息萬變,同時染色質也處于動態變化中,包含組蛋白、核小體等染色質結構的變化[8]。真核生物中,組蛋白被DNA緊密地纏繞形成核小體,一個核小體約含有147 bp的雙螺旋DNA。接著核小體再由鏈接DNA(linker DNA)連接并進行高度折疊形成染色質,最終將總長近2 m的基因組DNA分子包裝進細胞核中[9-10]。當特定的轉錄因子結合到可接近的染色質區域后,募集轉錄相關蛋白和RNA聚合酶,使附近的基因開始轉錄[11]。此時，由于轉錄因子與染色質可接近區的DNA發生結合，原有的核小體被取代呈現出裸露狀態。[12]

研究發現染色質上不同區域的DNA對核酸酶的敏感性差異明顯,其中易受DNA酶I作用的位點稱為DNA酶I超敏感位點(DNaseI hypersensitive site)[13-14]。染色質在染色質重塑因子的作用下,通過改變核小體的裝配、拆解和重排等方式來發生重塑[15]。重塑后的染色質結構或趨于疏松,或趨于致密[16-17]。其中經過重塑后結構趨于疏松的染色質,表現出對DNA酶I的高度敏感,核小體結構消失或排列松散等特性,稱為染色質可接近性[18]。

2 研究染色質可接近性的生物學意義

基因轉錄調控過程中,真核細胞中染色質的可接近性處于動態變化中:處于疏松狀態的染色質增加了轉錄因子對染色質DNA的可接近性,使得RNA聚合酶能募集到特定DNA序列上,從而激活基因的轉錄；處于致密狀態的染色質使得轉錄因子和RNA聚合酶對染色質DNA的可接近性減弱,從而抑制基因的轉錄。以往的研究主要關注特定的某一個具有調控功能的順式作用因子和其反式作用元件在轉錄調控發揮的作用,同時需要借助包括RNA-seq,ChIP-seq在內的多個組學進行切入。而當我們對染色質可接近性在基因組層面有全局的認識后,可以了解整個轉錄的活性和惰性區域,從而更加精確的了解基因的轉錄調控機制或規律[19]?；诖烁拍?研究人員啟動了人類基因組調控元件百科全書計劃(encyclopedia of DNA elements,ENCODE),從多個角度來解碼調控元件與轉錄因子和染色質之間復雜的相互關系[20]。

染色質的可接近性在整個基因調控過程中也與核小體的動態定位息息相關。核小體對于染色質DNA片段選擇的特性稱為核小體定位。于較疏松的染色質區域來說,其擁有數量較多的核小體；對于處于較開放狀態的染色質區域來說,其擁有數量較少的核小體且大部分轉錄因子的結合位點得以暴露,使得基因的轉錄可以順利進行。當我們對轉錄失調節的腫瘤基因組無從下手時,可以轉變思路去探究失調的基因組中核小體定位、染色質可接近性是否發生改變,便可以解碼基因轉錄調控中的有效的調控元件,為深入認識腫瘤的基因調控提供了新的思路。

3 研究染色質可接近性的技術

隨著第2代高通量測序技術的到來,BOYLE[21]等利用DNaseⅠ酶對染色質上已有的超敏感位點切割的特性,將其酶切后的染色質DNA片段進行測序文庫構建,并進行二代測序,得到了人CD4+T細胞中數萬個DNA酶I超敏感位點?；贒Nase-seq技術可以識別不同類型的具有活性的基因調控元件[22]。FAIRE測序(FAIRE-seq)技術則是利用超聲打斷與高通量測序技術相結合的方式來鑒定的開放染色質區,其利用了開放的染色質區易于被超聲打斷的原理[23]。由于超聲打斷的技術要求和甲醛交聯的條件不易明確等缺陷而沒有被研究人員大量應用。ATAC 測序(ATAC-seq)技術則是利用了Tn5轉座子在開放的染色質區域的偏好插入的特性進行鑒定染色質的可接近性[24]。由于其對樣本的需求量較低,且整個實驗流程簡單快速的優點而受到研究人員的青睞,而廣泛應用[25-28]。隨著人們對染色質可接近性探索的深入,研究人員發現ATAC-seq存在對較大的染色質可接近區的偏好選擇的缺點,使得較小的染色質可接近區會被忽略。于是,SOS等[29]改進了ATAC-seq的實驗流程,發明了THS-seq(transposome hypersensitive sites sequencing)使得對染色質可接近區的鑒定更加完整。表1對現有基于高通量測序手段鑒定染色質可接近區技術進行了歸納和總結。

表1 利用高通量技術檢測開放染色質位點的技術比較

技術名稱樣品細胞量要求(個)技術特點DNase-seq5× 106基于DNase Ⅰ特性FAIRE-seq1× 106～5× 107基于超聲打斷ATAC-seq5×102～5×104基于轉座子THS-seq1×102基于ATAC-seq基礎改進

4 染色質可接近性在前列腺癌研究的應用

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是男性泌尿生殖系統最常見的惡性腫瘤。根據2018 年全球癌癥統計報告,前列腺癌的發病率已高居整個男性腫瘤發病率的第二位[30]。前列腺癌中,雄激素受體(androgen receptor,AR)在維持雄性表型和前列腺癌的發生、進展中起關鍵作用[31-32]。人們發現AR信號通路所介導的轉錄調控可以導致前列腺上皮細胞的特異性轉化,驅動前列腺癌的發生,與去勢抵抗性前列腺癌的進展有關[33]。CHEN等[34]發現在雄激素或特異性配體的作用下,AR作為轉錄因子進入細胞核內來調控靶基因的轉錄,引起靶基因的轉錄激活或轉錄抑制。TEWARI等[35]利用DNase-seq技術結合AR-ChIP-seq 和RNA-seq數據,詳細分析了前列腺癌細胞LNCaP細胞在雄激素處理前后的基因轉錄的改變。雄激素激活后的AR會引起全基因組范圍的染色質結構發生改變,這些變化的位點具有明確的AR結合位點和與轉錄應答有關等特點。與其他的DNA結合因子所不同的是,AR的結合位點不僅僅局限在雄激素處理前就已經可以接近的染色質區域,而是主動增加基因組其他位點的染色質的可接近性,從而影響基因的表達[36]。以上研究指出AR-轉錄調控和染色質結構之間有著動態的定量平衡關系,為前列腺癌在去勢治療前后應答的改變建立了理論基礎。去勢抵抗性前列腺癌患者中大約有37%存在視網膜母細胞瘤基因(retinoblastoma,RB)的突變,且這種突變往往和極差的臨床預后有關。MCNAIR[37]等結合多種高通量技術,從轉錄組、順反子組、染色質結構組等多個組學出發,闡明了RB蛋白的缺失差異性地重編程了E2F1在基因組的分布,改變了整個原有的轉錄調控網絡從而趨向于惡性進展。利用ATAC-seq技術,作者系統性的分析了在RB缺失前后整個染色質的開放和關閉程度的變化情況,得出了E2F1的重編程不是由于整個染色質的可接近程度變化引起的結論。CHEN等[34]利用ChIP-exo(chromatin immunoprecipitation-exonuclease)技術對AR蛋白不同的配體進行測序分析染色質結構會影響AR結合。在這一觀念的基礎上,其又整合ATAC-seq和ChIP-exo數據分析發現AR剪切變異體7(AR-V7)和AR蛋白在前列腺癌不同階段有著不同的結合偏好性。在進一步分析的基礎上,CHEN等[38-39]也發現HoxB13作為AR-V7驅動的轉錄組的關鍵上游調節因子,表明HoxB13可以作為AR-V7驅動的前列腺腫瘤的治療靶標。利用染色質可接近性和其他組學的整合分析,越來越受到研究者的重視和應用。

在前列腺癌的新藥研發和臨床前藥物作用機理的研究中,染色質組學也越來越受到人們的關注。XIAO 等[40]利用RNA-seq,ChIP-seq和ATAC-seq三個組學整合分析,發現使用反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASO)共同靶向EZH2(Enhancer of zeste homolog 2)和AR后能明顯對去勢抵抗性前列腺癌產生抑制和殺傷作用。借助ATAC-seq作者發現單獨ASO靶向EZH2后,會引起染色質的可接近性大大增強,這提示整個腫瘤細胞在藥物處理后轉錄水平可能會明顯升高。在結合ChIP-seq數據和RNA-seq數據共同分析后,該藥物可以重編程AR的順反子組同時上調整個AR信號通路,這一改變也增強了其對AR靶向藥物的敏感性。這為應用雙靶向的ASO藥物在CRPC患者的治療提供了充足的理論基礎和臨床前數據支持。

在整個腫瘤的基礎研究中,染色質可接近性這一概念也開始得到廣泛的認知和應用[41-43]。無論是在對前列腺癌中特異的轉錄失調節的研究中,還是在對CRPC患者治療的藥物研發中均得到廣泛應用。

5 展 望

利用ATAC-seq 或THS-seq 技術,我們可以對整個基因組的染色質開放與否的全貌進行觀察和分析。在整個基因轉錄調節研究中,我們越來越發現僅僅利用一個組學是不能對整個紛繁復雜的轉錄調控過程進行解讀的[25-27,44]。而將染色質可接近性和染色質組學融入整個轉錄調控關系的研究中,會使得我們能從染色質層面去解讀以前未能解開的轉錄謎題,使得我們能更進一步地對基因轉錄調控進行研究和應用。