“紅勛1號”紅肉蘋果多酚抗氧化與抗癌活性

齊娜 雷佳蕾 鄧紅 穆韋彤 劉旻昊 孟永宏 郭玉蓉

摘要在前期提取純化紅肉蘋果多酚及分析組成的基礎上，通過3項抗氧化試驗探討多酚抗氧化能力，并用MTT法和熒光染色法研究多酚的抗癌活性。體外抗氧化試驗結果表明，濃度為0.80 mg/mL紅肉蘋果多酚的總還原力與VC持平，0.60 mg/mL的多酚對ABTS+具有良好的清除作用（清除率94.11%），且對Cu2+/H2O2誘導的BSA蛋白氧化損傷具有明顯的保護作用。MTT試驗顯示紅肉蘋果多酚對3種癌細胞（HepG2、Hela、A549）的增殖均有明顯抑制作用（IC?50值分別為0.687、0.405、0.635 mg/mL），且對Hela癌細胞的抑制率最高達65.19%;臺盼藍染色、AO/EB及DAPI熒光染色試驗發現，多酚濃度增大Hela細胞凋亡明顯，且細胞內線粒體膜電位降低，活性氧水平升高，呈劑量依賴性。紅肉蘋果多酚具有良好的抗氧化活性，可顯著誘導Hela細胞的凋亡，可作為天然抗氧化、抗癌食品基料進行深入開發利用。

關鍵詞“紅勛1號”紅肉蘋果;多酚;抗氧化活性;抗癌活性

中圖分類號TS?201文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）18-0167-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.045

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Antioxidation and Anticancer Activity of Polyphenols from Red-flesh Apple of Hongxun No.1

QI Na， LEI Jia-lei， DENG Hong et al

（College of Food Engineering and Nutritional Science， Shaanxi Normal University， Xian， Shaanxi 710062）

AbstractBased on the extraction， purification and composition analysis of polyphenols from red-flesh apple， the antioxidant capacity of polyphenols from red-flesh apple was examined through three antioxidant test in vitro. The anticancer activity of polyphenols from red-flesh apple was determined by MTT assay and fluorescent staining mehods. The antioxidant test results in vitro showed that the total reducing power of polyphenols from red-flesh apple of 0.80 mg/mL， which was equal to VC， 0.60 mg/mL polyphenols had significant free radical-scavenging effect on the ABTS+ with clearances ratio of 94.11%. The polyphenols of red-flesh apple also had obvious protective effect for the oxidation damage of BSA protein induced by Cu2+/H2O2. The MTT assay experiments showed that the polyphenols had notable inhibitory capabilities on the cancer cells proliferation of Hela， HepG2 and A549 （ IC?50 of 0.405， 0.687 and 0.635 mg/mL， respectively）， and had highest inhibition rate of ?65.19% on Hela cancer cells. Then the apoptosis phenomenon of Hela cells was distincted with the polyphenol concentration increased after Trypan blue， AO-EB and DAPI fluorescence staining and Hela cells apoptosis occurred in a dose-dependent manner， while intracellular mitochondrial membrane potential decreased and reactive oxygen species levels increased. The polyphenols from red-flesh apple displayed good antioxidant activity and could significantly induce the apoptosis of Hela cells， it will be used as an anti-cancer or/and natural anti-oxidation material in food industry for further development and utilization.

Key wordsRed-flesh apple of Hongxun No.1;Polyphenols;Antioxidation activity;Anticancer activity

我國是世界上最大的蘋果栽培生產國，有豐富的蘋果資源[1-2]，其中的新疆野蘋果作為現代栽培蘋果（Malus domestica Borkh.）的祖先種遺傳多樣性豐富、種質利用潛力大。紅肉蘋果（Malus sieversii f.neidzwetzkyana（Dieck）Langenf）是新疆野蘋果[3]中的一種珍貴資源，果實外觀獨特，生物活性物質豐富，鮮果中多酚、果酸、類黃酮、Ca含量高，具有很好的營養保健特性[4]。

目前對紅肉蘋果的研究主要有遺傳多樣性[5-6]、類黃酮[7]、花青苷的組分含量[8-9]以及紅色發育機理[10]等方面，其中王燕等[9]發現“紫紅1號” 紅肉蘋果抗氧化能力是白肉蘋果的7倍。劉羽等[4]研究了新疆3種品系紅肉蘋果果皮和果肉中的糖、酸、揮發性成分的組成與含量，評價其抗氧化能力。齊娜等[11]采用響應面法優化了超聲輔助提取新疆“紅勛1號”紅肉蘋果多酚（得率2.135 mg/g）的條件。Wang等[12]發現新疆紅肉蘋果的酚類物質具有很好的抗氧化能力，具有非常重要的食用與藥用開發價值。

人類很多疾病的發生都與氧化應激密切相關，研究發現多酚可中斷氧化反應鏈、清除自由基、淬滅單線態氧等防止氧化反應的發生，還能調控致癌過程中的關鍵酶等[13-14]。蘋果是最重要的膳食多酚來源[15]，但不同品種蘋果多酚由于結構含量的差異其活性不同。紅肉蘋果多酚具有極強的抗氧化活性，進而推斷其有良好的抗癌活性，但是目前鮮見同時評價紅肉蘋果多酚抗氧化與抗癌活性的報道。

該研究在前期對多酚進行提取、純化、組成分析的基礎上，采用3項體外抗氧化試驗明確新疆紅肉蘋果多酚的抗氧化能力;并用MTT法研究該多酚對3種癌細胞增殖的抑制效果，用熒光染色法探討多酚對Hela細胞內線粒體膜電位和活性氧的影響，為紅肉蘋果多酚在功能食品等領域的應用提供數據。

1材料與方法

試驗于2017年5—12月在陜西師范大學食品工程與營養科學學院進行。

1.1材料

“紅勛1號”紅肉蘋果于2016年9月下旬蘋果成熟季采自新疆塔城，大小均一、成熟度相同、無機械損傷和病蟲害，摘后包裝低溫冷鏈運輸，貯藏于1303實驗室-18 ℃冰箱，待用。

試驗所用的細胞株（HepG2、Hela、A549）、生化試劑（MTT、DMSO、DAPI）、試劑盒（活性氧檢測、吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）、JC-1法線粒體膜電位檢測）均與文獻?[16]相同。

1.2設備與儀器

SB25-12DTDN超聲波機、YHLGJ-10真空冷凍干燥機、Thermo高效液相色譜儀、Multiskan Go全波長酶標儀、ESCO生物安全柜、BG-verMINI迷你垂直電泳儀、CO2恒溫培養箱、DMI3000B/DFC450C Leica倒置熒光顯?微鏡[16-17]。

1.3方法

1.3.1紅肉蘋果多酚的制備。提取紅肉蘋果多酚[11]，再純化多酚[16]，分析其組成成分，并冷凍干燥純化后的“紅勛1號”紅肉蘋果多酚，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.3.2紅肉蘋果多酚的抗氧化活性。

1.3.2.1

紅肉蘋果多酚對ABTS+自由基的清除作用。分別以VC作為陽性對照，蒸餾水為陰性對照，制備多酚與ABTS+混合溶液[16]，測定吸光值，根據下式進行計算：

清除率=[AC-（ A-A0）]/ AC×100%（1）

式中，A為紅肉蘋果多酚溶液在734 nm的吸光值;AC為陰性對照組的吸光值;A0為本底的吸光值。

1.3.2.2紅肉蘋果多酚總還原力的測定。制備混勻液和測定吸光值[20]。以VC為陽性對照，70%的乙醇溶液作為本底對照，再根據下式進行計算：

吸光值=A-A0（2）

式中，A為紅肉蘋果多酚溶液在734 nm的吸光值;A0為本底的吸光值。

1.3.2.3

紅肉蘋果多酚對Cu2+/H2O2誘導BSA蛋白氧化損傷的保護作用。①變性[17];②依次進行制膠、上樣、電泳、染色、脫色、圖像分析[18]。

1.3.3紅肉蘋果多酚的抗癌活性。

1.3.3.1細胞的培養方法。進行細胞的復蘇、傳代、凍存[18-19]。

1.3.3.2

MTT法測定紅肉蘋果多酚對癌細胞增殖的抑制作用。分別培養人宮頸癌Hela細胞、肝癌HepG2細胞和肺癌A549細胞至對數生長期，進行MTT試驗[18-19]，根據以下公式計算出癌細胞的存活率，存活率= 1-（空白對照組吸光?值-樣品試驗組吸光值）/空白對照組吸光值×100%。

1.3.3.3

臺盼藍染色。進行臺盼藍染色試驗[19]，在倒置顯微鏡下觀察各孔內細胞形態以及染色狀態，并拍照記錄。

1.3.3.4

AO/EB和DAPI熒光染色。進行AO和EB染色、DAPI染色[19]，放于倒置熒光顯微鏡下觀察各孔內細胞的特征，并進行拍照保存。

1.3.3.5

Hela細胞線粒體膜電勢的測定。用新疆紅肉蘋果多酚處理Hela細胞后[20]，吸掉培養液，用PBS清洗2遍后，按照試劑盒說明書進行操作，將處理好的樣品立即放置于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。

1.3.3.6

Hela細胞內活性氧（ROS）的測定。用新疆紅肉蘋果多酚處理Hela細胞后[20]，按照試劑盒說明書進行操作，同樣將處理好的樣品立即放置于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。

1.4數據統計分析方法采用Design-Expert10.0及DPS軟件處理數據。

2結果與分析

2.1紅肉蘋果多酚的抗氧化活性

新疆紅肉蘋果多酚對ABTS+自由基的清除作用如圖1a所示，新疆紅肉蘋果多酚總還原力如圖1b所示，新疆紅肉蘋果多酚對Cu2+/H2O2誘導BSA蛋白氧化損傷的保護作用如圖1c所示。

從圖1a可以看出，VC和新疆紅肉蘋果多酚均對ABTS+自由基具有很強的清除作用，并且表現出明顯的劑量依賴性;當濃度達0.60 mg/mL時，多酚的清除率達94.11%（VC的清除率為93.30%），二者的清除能力基本相同。從圖1b可以發現，VC和新疆紅肉蘋果多酚的還原能力都比較強，且有顯著的劑量依賴性;當溶液濃度達0.80 mg/mL時，還原力逐漸趨于穩定，VC與紅肉蘋果多酚二者的還原力基本相同。

在生物體中·OH的量高于正常水平時，便會對生物大分子產生攻擊，最終導致蛋白質的氧化損傷。而新疆紅肉蘋果多酚可對氧化損傷起到保護作用;作用越強，電泳條帶顏色越深，則灰度值越大。從圖1c可以看出，加入新疆紅肉蘋果多酚的電泳條帶的灰度值均高于陰性對照（0 mg/mL），并且呈劑量依賴性，逐漸增大。當多酚濃度達3.2 mg/mL時，電泳條帶灰度值高于空白組。該結果表明，新疆紅肉蘋果多酚對Cu2+/H2O2誘導BSA蛋白氧化損傷具有很強的保護作用，且表現出劑量依賴性。

2.2紅肉蘋果多酚的抗癌活性

2.2.1紅肉蘋果多酚的抗癌效果。

2.2.1.1

MTT試驗結果。從圖2a可以看出，新疆紅肉蘋果多酚對3種癌細胞的增殖均具有明顯的抑制作用，并呈時間和濃度的依賴性，但是作用效果不同。多酚作用于3種癌細胞的IC?50值分別為0.405、0.687和0.635 mg/mL，對Hela細胞的抑制效果最為明顯（細胞活力僅34.81%，抑制率65.19%）。由圖2b可知，新疆紅肉蘋果多酚對Hela細胞作用6、12和?24 h時，均具有明顯的抑制作用，且不同時間下IC?50值分別為0.635、0.405和0.360 mg/mL。根據抑制效果和時間經濟，選擇12 h為處理時間。

2.2.1.2

細胞染色試驗結果。①臺盼藍染色。臺盼藍染色可快速區分活細胞和死細胞[21]。紅肉蘋果多酚對Hela細胞形態的影響如圖3a所示，與無處理對照組（0 mg/mL）相比，紅肉蘋果多酚作用濃度為0.1 mg/mL時，可以觀察出已經有部分Hela細胞開始發生明顯的變化（皺縮、變小變圓、間隙逐漸增大），有少量細胞被染成藍色;隨著多酚濃度增加達?0.5 mg/mL時，細胞大部分發生皺縮凋亡現象，被染成藍色，基本失去原來的形態，且呈劑量依賴性。②熒光染色。吖啶橙（AO）在激發光下發出綠色熒光;溴化乙錠（EB）僅能與受損的細胞結合，在激發光下發出橘紅色熒光[22]。如圖3b所示，將不同濃度的新疆紅肉蘋果多酚作用于Hela細胞12 h后，對照組（0 mg/mL）Hela正?；罴毎尸F均勻綠色熒光，多酚作用濃度為0.1 mg/mL時，Hela細胞核染色質發生明顯固縮，細胞有逐漸變紅的趨勢（早期凋亡細胞），個別細胞完全呈橘紅色（晚期凋亡細胞）;隨著多酚濃度的增大，被染成橘紅色細胞的數量也增多。DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）熒光染色結果如圖3c所示，對照組（0 mg/mL）中的Hela細胞內部熒光染色均勻，當新疆紅肉蘋果多酚作用濃度為?0.1 mg/mL時，細胞形態發生變化，有個別細胞出現明顯的亮斑（細胞開始發生凋亡），當多酚濃度增加時，細胞亮斑的數量越來越多，凋亡現象也越來越明顯。這些顯著特征可以證明新疆紅肉蘋果多酚可有效誘導Hela細胞發生凋亡，并與其劑量呈正相關。

2.2.2紅肉蘋果多酚的抗癌機制。

2.2.2.1

紅肉蘋果多酚對細胞線粒體膜電位的影響。線粒體膜電位是一種反映細胞受損效應較靈敏的指標，當細胞發生凋亡時，線粒體功能發生紊亂，膜電位便發生變化[23]。采用JC-1熒光探針[24]測定細胞內線粒體膜電位的變化（圖4），與對照組（橘紅色熒光，膜電位高）相比，紅肉蘋果多酚可以明顯增強Hela細胞內綠色的熒光，當濃度達0.5 mg/mL時，細胞內幾乎完全呈現綠色熒光，說明膜電位低，而線粒體膜電位的下降是細胞早期凋亡的重要現象;細胞凋亡時由于線粒體膜巨型通道PT孔開啟，使得線粒體膜的通透性增大，膜兩側的離子重新分布，造成線粒體膜電位的迅速下降，所以線粒體膜電位的降低與細胞凋亡水平有密切關系。圖4顯示紅肉蘋果多酚可導致Hela細胞線粒體損傷和功能障礙，可顯著降低線粒體膜電位，且呈劑量依賴性。

2.2.2.2

紅肉蘋果多酚對活性氧生成的影響?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）是一種活潑的含氧化合物，過量的ROS可以激活細胞發生凋亡，可選擇藥物誘導細胞中ROS發生變化以抑制腫瘤細胞[25]。采用DCFH-DA熒光探針法測定了不同濃度的新疆紅肉蘋果多酚對細胞內ROS水平的影響（圖5）。DCFH-DA（無熒光）能夠穿過細胞膜被水解成DCFH，在細胞氧化劑作用下DCFH生成具有熒光的DCF，可根據熒光強度來反映細胞內ROS水平的高低。如圖5所示，和對照組（0 mg/mL）相比，紅肉蘋果多酚（0.5 mg/mL）處理過的Hela細胞的熒光顯著增強，且呈劑量相關性，說明紅肉蘋果多酚能刺激Hela細胞產生ROS，可能會減弱Hela細胞線粒體抗氧化防御機制，使線粒體活性氧產生增多，這與線粒體膜電位降低一致。

3結論

“紅勛1號”紅肉蘋果多酚對ABTS+自由基的清除作用與VC相當，同時該多酚具有較高的總還原力，對Cu2+/H2O2誘導BSA蛋白氧化損傷具有良好的保護作用。此外，紅肉蘋果多酚能夠有效抑制3種癌細胞（Hela、A549、HepG2）的增殖，且呈劑量依賴性;對Hela細胞抑制最為明顯（IC?50值為?0.405 mg/mL）。臺盼藍染色、AO/EB及DAPI熒光染色發現紅肉蘋果多酚處理后的Hela細胞發生明顯的凋亡，因為該多酚能夠降低Hela細胞線粒體膜電位，改變線粒體通透性，進而使細胞功能受損，發生凋亡，同時刺激Hela細胞中ROS的生成，發生氧化應激，誘導Hela細胞凋亡。

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