發酵型牡蠣調味液的研制及其營養價值研究

白 潔

(西華大學，成都 610039)

牡蠣(Oyster)屬軟體動物門、瓣鰓綱、異柱目、牡蠣科動物，是一種藥食同源、營養價值豐富的水產品，素有“海中牛奶”之稱[1]。其中，太平洋牡蠣(Crassostreagigas)的產量約占總牡蠣產量的1/3，其蛋白質、必需氨基酸含量高，口味鮮美，具有較高的利用價值[2]。

隨著生物科學技術的發展和人們生活水平的提高，高值化水產品的需求量大幅上升，水解蛋白產品則為其中最受歡迎的一種。蛋白質被水解后變成小分子肽，營養價值變高，功能性質也有所提升，被越來越多的研究者所青睞。豆類蛋白質、魚肉蛋白質水解產物均得到廣泛的研究，也有新的功效被發掘出來，如降血壓、降血糖、增強免疫力[3,4]。而牡蠣水解蛋白的研究則較為少見[5,6]。目前蛋白質水解的方法是加入商業用酶，例如木瓜蛋白酶、復合蛋白酶、堿性蛋白酶，而酶的成本較高，這對實際生產造成了一定影響，我們考慮用微生物發酵牡蠣來制備牡蠣水解蛋白，發酵液營養價值高，可用來制備新型調味液，豐富牡蠣的產品結構。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮太平洋牡蠣：購自成都市某水產品批發市場，于2 h內低溫運輸至實驗室；干酪乳桿菌(L．casei)：編號GIM1.190，購于CICC；MRS培養基：英國Oxoid公司；其他化學試劑：均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

MJ-PB80Easy210型破壁機 廣東美的生活電器制造有限公司；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機 美國Eppendorf公司；2300 自動凱氏定氮儀 瑞士FOSS 公司；L-8900全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；PHS-3E型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；桑普特電氣兩用殺菌鍋 諸城市金鼎食品機械有限公司。

1.3 牡蠣勻漿液培養基的制備

將牡蠣清洗干凈，取牡蠣肉，稱重，加入同樣質量的蒸餾水，放進破壁機中勻漿2 min。測定勻漿液的蛋白質含量[7]，加入5%(質量比)蔗糖，用質量分數為0.1%的活性炭脫腥脫色30 min，用蒸餾水稀釋至蛋白質含量為10%(質量比)，并且調節pH至7.0，置于500 mL錐形瓶中，于105 ℃滅菌20 min，冷卻，備用。

1.4 干酪乳桿菌發酵

將用MRS培養基活化過的干酪乳桿菌再次接種至MRS培養基，培養48 h，制成種子液，該種子液的濃度為106CFU/mL。將種子液接種到1.3方法制備的牡蠣勻漿液培養基中，接種量為8%，裝液量為30%，150 r/min的速度，在36 ℃的溫度下振蕩培養，在不同時間(0，1，2，3，4，5 d)取樣，在95 ℃水浴中煮沸15 min以滅酶，8000 r/min離心15 min，取上清液，則為牡蠣發酵液。

1.5 蛋白質回收率的測定

以GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》為參考，測定牡蠣勻漿液培養基和牡蠣發酵液的蛋白質含量，用下式計算蛋白質回收率。

1.6 ?；撬岷康臏y定[8]

參照GB/T 5009.169-2003中的高效液相色譜法進行測定。

1.7 氨基酸態氮含量的測定[9]

采用甲醛電位滴定法。

1.8 揮發性鹽基氮(TVBN)的測定

采用康衛氏皿擴散法。

1.9 氨基酸組成的測定[10]

稱取一定量牡蠣勻漿液培養基、牡蠣發酵液，加入6 mol/L HCl(含有1%苯酚)，在105 ℃水解24 h，定容，成水解液。吸取20 mL上述水解液真空干燥，樣品衍生，再次進行干燥。將樣品稀釋液與干燥樣品混合溶解，以8000 r/min的轉速、4 ℃的溫度離心15 min，高效液相分析。色譜柱：PICO-TAG柱，長度150 mm；流動相A：醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 6.5)；流動相B：60%乙腈溶液；檢測波長254 nm；流速1.0 mL/min。

1.10 牡蠣發酵調味液的制備及感官評價

按照1.4方法制備好的牡蠣發酵液加入0.1%(W/V)的高甲氧基果膠作為穩定劑，再加入0.2%(W/V)的甜味劑，灌裝，冷卻，制備成牡蠣發酵調味液。在4 ℃靜置24 h后對牡蠣發酵調味液進行感官評價。

1.11 牡蠣發酵調味液體外ACE抑制活性測定[11]

采用HPLC法測定體外ACE抑制活性，將50 μL牡蠣發酵調味液與等量ACE酶液(25 mU)混合，加入80 μL濃度為2.5 mmol/L的馬尿酸-組氨酰-亮氨酸-硼酸緩沖液，在37 ℃反應60 min，加入250 μL 1 mol/L的HCl將反應終止，過膜，HPLC進樣。

色譜條件：色譜柱ZORBAX SB-C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A為超純水(0.08% TFA)；流動相B為100%乙腈(0.08% TFA)；柱溫：25 ℃；流速：0.5 mL/min；進樣量：50 μL；檢測波長：228 nm。

1.12 數據分析

將實驗數據用SPSS 19.0、Origin 8.1進行分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白質回收率

測定不同發酵時間牡蠣發酵液的蛋白質回收率，結果見圖1。

圖1 蛋白質回收率和?；撬岷侩S發酵時間的變化

發酵時間對蛋白質回收率的影響比較大，隨著發酵時間的延長，蛋白質回收率先急劇增加后緩慢增加，從第0天時的44.7%增加到第5天時的91.5%，實際上，第4天時的蛋白質回收率為88.3%，已接近第5天的最大值，二者無顯著性差異(p>0.05)。接種的干酪乳桿菌能夠很好地利用蛋白質，可將不溶性大分子蛋白有效降解成可溶性小分子蛋白，故可增大蛋白質回收率[12]。較高的蛋白質回收率證明用干酪乳桿菌發酵牡蠣勻漿液來制備牡蠣水解液，進而制備牡蠣發酵調味液的可行性。

2.2 ?；撬岷?/h3>

牡蠣營養價值的一個獨特之處在于它的?；撬岷繕O高，測定不同發酵時間牡蠣發酵液的?；撬岷?，結果見圖1。未發酵的牡蠣勻漿液?；撬岷繛?80 mg/dL，隨著發酵時間的延長，?；撬岷肯却蠓黾雍筅呌谄椒€，最高達到586 mg/dL。發酵過程并沒有使?；撬岷拷档?，反而升高了其含量，這可能歸功于干酪乳桿菌所產生的各種酶的作用。

2.3 氨基酸態氮含量

測定不同發酵時間牡蠣發酵液的氨基酸態氮含量，結果見圖2。

圖2 氨基酸態氮含量和TVBN隨發酵時間的變化

隨著發酵時間的延長，氨基酸態氮含量明顯增加，在發酵后期達到平穩，在第5天時達到0.98 mg/100 g。牡蠣中的蛋白質含量較高，在干酪乳桿菌的作用下，大分子蛋白質被分解為小分子肽或游離氨基酸，發酵時間越長，干酪乳桿菌產生的蛋白酶越多，被酶分解出的游離氨基酸越多，故氨基酸態氮含量也越多，這有助于腸道對蛋白質的消化吸收，牡蠣發酵液營養價值大幅提高[13]。

2.4 TVBN

牡蠣作為一種濾食性海洋生物，身上有很多微生物，這些微生物會引起牡蠣品質變化。揮發性鹽基氮(TVBN)是由于酶和細菌的作用，使蛋白質分解產生氨、三甲胺、甲胺等堿性含氮物質，會使牡蠣腐敗。由圖2還可知，未發酵的牡蠣勻漿液的TVBN含量較低，為37.7 mg/100 g，而經過發酵的牡蠣發酵液的TVBN含量有所上升，尤其在第5天明顯上升。TVBN含量的上升是因為加入的干酪乳桿菌所致，其使大分子蛋白質分解，產生很多游離氨基態氮，這其中就有氨、三甲胺、甲胺等物質，發酵時間越長，這些物質累積越多。鑒于TVBN含量過高對感官、品質等方面均會產生不良影響，制作牡蠣發酵調味液時，發酵時間不宜過長，要綜合考慮。

2.5 氨基酸組成

測定不同發酵時間牡蠣發酵液的氨基酸含量，結果見表1。

表1 氨基酸含量隨發酵時間的變化

由表1可知，牡蠣發酵液的氨基酸組成非常完善，必需氨基酸含量高，所占比例在42.7%～43.1%之間，具有較高的營養價值。并且嬰兒必需的精氨酸含量也相當高，所占比例在22.1%～23.6%之間，符合嬰兒的營養需求?？偘被岷坑傻?天的91.46 mg/dL上升到第4天的最高值97.89 mg/dL，而第5天含量有所下降，為97.45 mg/dL。在所測試的17種氨基酸中，除了組氨酸、丙氨酸外，其余氨基酸沒有明顯下降，基本都呈上升趨勢[14]。干酪乳桿菌發酵牡蠣使牡蠣蛋白質更易被吸收，除此之外，特定的氨基酸還可能起到更多的健康作用，例如抗氧化、抗高血壓、抑制ACE、增強免疫力等，起到了營養強化的作用。

2.6 牡蠣發酵調味液感官評價

不同發酵時間制作的牡蠣發酵調味液的感官評分見表2。

表2 牡蠣發酵調味液感官評價

由表2可知，未經發酵(0 d)制作的調味液的總評分較低，有較重的牡蠣腥味，嘗起來酸澀，顏色較黃，略有沉淀。隨著發酵時間的延長，牡蠣發酵調味液的總評分有很大提高，但是發酵時間過長，評分又略有下降。發酵1，2，3，4 d制作的牡蠣發酵調味液風味獨特，有清香的牡蠣味，沒有腥味，爽口，酸度適宜，呈象牙白色，組織均勻、無沉淀。發酵5 d制作的牡蠣發酵調味液缺乏牡蠣香味，反而有酸臭味，后味較重，酸味偏重，呈黃色，略有沉淀，這可能是因為發酵過度，較高的TVBN引起輕微腐敗，導致感官品質下降[15]。故實際生產中可以采用發酵4 d。

2.7 牡蠣發酵調味液體外ACE抑制活性

測定不同發酵時間牡蠣發酵液制成的牡蠣發酵調味液的體外ACE抑制活性，結果見圖3。

圖3 ACE抑制能力隨發酵時間的變化

未發酵的牡蠣勻漿液本身就具有較高的ACE抑制活性(47.5%)，經過1 d干酪乳桿菌的發酵，牡蠣發酵調味液體外ACE抑制活性急劇增大，然后緩慢增加至平穩，在第5天達到最大值83.6%?？梢姲l酵前后兩者的體外ACE抑制活性有顯著差異，可能是在干酪乳桿菌所產的蛋白酶等酶類的作用下，蛋白質分解成特定肽段或氨基酸，這些肽段或氨基酸與ACE活性區域親和力較強，產生競爭性抑制，可能產生降血壓的良好效果。有研究表明[16]，含有較高含量的疏水氨基酸(如纈氨酸、異亮氨酸)支鏈時，ACE抑制活性較強，上述結果表明，發酵后，纈氨酸、異亮氨酸含量有所增加，這可能是牡蠣發酵調味液具有較好體外ACE抑制活性的主要原因。

3 結論

以太平洋牡蠣肉為原料，將干酪乳桿菌接種至牡蠣勻漿液，發酵不同時間，測定了發酵液的蛋白質回收率、?；撬岷?、氨基酸態氮含量、TVBN含量、氨基酸組成。用發酵液進一步制成牡蠣發酵調味液并進行感官評價，測定了其體外ACE抑制活性。結果表明，隨著發酵時間的延長，上述指標均有所增加，其中發酵液的蛋白質回收率高達91.5%，?；撬岷孔罡哌_到586 mg/dL，氨基酸態氮含量在第5天時達到0.98 mg/100 g，TVBN含量在第5天明顯上升，氨基酸含量在第4天時達到最高值97.89 mg/dL，營養價值大幅提高。牡蠣發酵調味液具有較高的感官評分，尤其是發酵4 d的調味液，風味獨特，有清香的牡蠣味，沒有腥味，爽口，酸度適宜，呈象牙白色，組織均勻，無沉淀。牡蠣發酵調味液還能明顯提高體外ACE抑制活性，ACE清除率最高可達83.6%。本研究為牡蠣高值化利用提供了理論依據，為牡蠣產品的開發提供了新的思路。