老鴉瓣黃酮的制備及其穩定性研究

汪道兵，高青海，孫玉軍

（安徽科技學院 a.農學院；b 生命與健康科學學院，安徽 鳳陽 233100）

0 引言

老鴉瓣（Tulipa edulis）為百合科郁金香屬草本植物，別名迎春草［1-2］。老鴉瓣的鱗莖為中藥材光慈菇，具有清熱解毒、消腫、抑菌、抗腫瘤等功效［3-4］，多用于治療痢疾、痛風、咽喉腫痛、蛇蟲狂犬傷等［5］。自20世紀90年代以來，國內外學者對光慈菇進行了相關研究，分離得到糖類、生物堿、菲類、黃烷酮類和苷類等50 多種化合物，這些化合物表現出多種藥理活性，包括抗腫瘤、抗菌、降壓、抗氧化等功能［6］。在民間，夏季將老鴉瓣葉片與面條一起蒸煮以防面條變餿變味。

黃酮類化合物在中藥材中分布廣泛，是藥用植物的有效成分之一。研究發現老鴉瓣葉片黃酮具有較強的抗氧化性［7］和抑菌活性，但關于其性質未見報道。據此，本試驗以老鴉瓣葉片為材料，通過提取、分離純化制備老鴉瓣黃酮，研究其穩定性，為老鴉瓣資源的開發及其黃酮的利用提供參考。

1 材料、儀器與試劑

老鴉瓣（安徽省蒙城縣南望槐種植專業合作社饋贈，由安徽科技學院中藥學教授劉漢珍鑒定為老鴉瓣。將老鴉瓣葉片烘干，粉碎，過100 目篩，備用。

AR2140 型電子天平（梅特勒-托利多有限公司），U-T6PC 型紫外可見分光光度計（上海屹譜儀器制造有限公司），YRE-5299 型旋轉蒸發儀（鞏義市予華儀器有限責任公司），BSZ-100 型自動部分收集器（上海嘉鵬科技有限公司），pH-3C 型酸度計（上海佑科儀器儀表有限公司），PE-1730 型紅外光譜儀（美國PEAKIN-ELMER 公司）。

槲皮素標準品（國藥集團化學試劑有限公司，批號LOT.NO.F20051117），D-101 型大孔樹脂（安徽三星樹脂科技有限公司），蔗糖、檸檬酸、維生素C（AR，國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 老鴉瓣黃酮的制備

2.1.1 制備流程 取老鴉瓣葉片過篩粉末→加入乙醇→恒溫水浴浸提→離心→上清液旋轉蒸發→D-110 大孔樹脂柱層析→收集洗脫液→旋轉蒸發→冷凍干燥→老鴉瓣黃酮。

2.1.2 老鴉瓣黃酮的提取 稱取一定量的老鴉瓣過篩粉末，按汪道兵等［7］的方法優化得到的工藝（65%乙醇、料液比1∶20（g·mL-1）、溫度 65 ℃、浸提時間 80 min）進行提取，提取液 4 500 r·min-1離心15 min，沉淀再浸提一次，合并上清液，旋轉蒸發濃縮，得老鴉瓣黃酮濃縮液。

2.1.3 老鴉瓣黃酮的分離純化［8］將經無水乙醇預處理的D-101 大孔樹脂裝柱（2.6 × 50 cm），65 %乙醇平衡3 倍柱床體積后，老鴉瓣黃酮濃縮液上樣，65%乙醇洗脫，自動部分收集器收集，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 顯色法［9］逐管檢測，收集含黃酮部分，合并洗脫液，旋轉蒸發濃縮，冷凍干燥得淡黃色固體干粉。經溶解性能測定，發現老鴉瓣黃酮易溶于不同濃度的乙醇、易溶于水，這與大多數黃酮難溶于水的性質不同。因此，老鴉瓣黃酮具有良好的醇溶性和水溶性的特點，應用范圍將會更加廣泛。

2.2 老鴉瓣黃酮的鑒定

2.2.1 鹽酸鎂粉反應［10］取適量的凍干粉于試管中，加入65%乙醇溶解，再加入少許Mg 粉搖振后滴加幾滴濃鹽酸，搖振后有紫紅色泡沫出現，根據特征顏色反應，表明制備的物質含有黃酮類化合物。

2.2.2 紫外可見光譜掃描［11］槲皮素和老鴉瓣黃酮分別采用65%乙醇溶解，按文獻［9］的方法加入試劑反應后，于200 ～600 nm 波長范圍內掃描，見圖1。結果發現，老鴉瓣黃酮（B）和槲皮素（A）的圖譜十分相似，均在372 nm 附近有吸收峰，這與文獻［12］報道相似，因此將372 nm 作為老鴉瓣黃酮含量的測定波長。但老鴉瓣黃酮的紫外光譜與槲皮素不完全相同，這表明老鴉瓣黃酮除含有槲皮素外還含有其他物質。

2.2.3 紅外光譜掃描［11］分別稱取3 mg 老鴉瓣黃酮于瑪瑙研缽中，再加入100 mg KBr 粉末，研磨混勻，壓片，采用PE-1730 紅外光譜儀于波數400 ～4 000 cm-1區間掃描，見圖2。由圖2可知，老鴉瓣黃酮的主要強吸收峰有 3 397、2 925、2 854、1 739、1 604、1 457、1 247、1 209、1 052、588 cm-1等，其中3 397、2 925、1 604、1 052 cm-1與蘆?。?3］的官能團相似，波數2 854、1 457、1 209、588 cm-1處的吸收峰與槲皮素［14］的官能團相似，而波數1 739、1 247 cm-1處的吸收峰分別是糖的乙酰酯和C—H 變角振動引起的。因此從老鴉瓣中提取得到的物質為含有槲皮素和蘆丁等的黃酮類化合物，其部分基團可能被糖類物質所取代。

圖1 槲皮素（A）和老鴉瓣黃酮（B）的紫外可見掃描圖譜Fig.1 UV spectra of quercetin (A)and flavonoids from Tulipa edulis(B)

圖2 老鴉瓣黃酮的紅外光譜Fig.2 FT-IR spectra of flavonoids from Tulipa edulis

2.3 老鴉瓣黃酮含量測定

以槲皮素為標準品，按照文獻［9］操作方法繪制標準曲線，得出標準曲線回歸方程:Y= 1.072 9X+0.002 1，Y表示吸光度，X表示槲皮素的含量，R2= 0.999 8。按標準曲線操作測得老鴉瓣黃酮的含量為63.09%。

2.4 老鴉瓣黃酮穩定性考察

2.4.1 溫度對老鴉瓣黃酮穩定性的影響 于每支試管中加入1 g/L 老鴉瓣黃酮水溶液5 mL，分別置于25、35、45、55、65、75、85、95 ℃的恒溫水浴鍋中避光恒溫1 h，然后取出冷卻至室溫，按文獻［9］的方法加入試劑反應后，于372 nm 波長下測定吸光度（根據紫外可見掃描圖譜，確定以A372值來表示黃酮相對含量的多少，下同），考察溫度對老鴉瓣黃酮穩定性的影響，見圖3。結果發現，在25 ～85 ℃溫度范圍內，老鴉瓣黃酮的A372值變化不大（P＞ 0.05），當溫度大于 85 ℃時，A372突然增大，影響顯著（P＜ 0.05），其原因可能是溫度過高破壞了老鴉瓣黃酮的分子結構，產生更多的酚羥基導致的。這和王麗娟等［14］研究溫度對黑苦蕎黃酮穩定性的結果相似。因此，老鴉瓣黃酮應在低于85 ℃的條件下保存或者使用。

圖3 溫度對老鴉瓣黃酮穩定性的影響Fig.3 Effect of temperature on stability of flavonoids from Tulipa edulis

2.4.2 pH 對老鴉瓣黃酮穩定性的影響 于每支試管中加入1 g/L 老鴉瓣黃酮水溶液5 mL，調pH 值依次為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，靜置30 min 后，按文獻［9］的方法方法加入試劑反應后，于372 nm 波長下測定吸光度，考察pH 對老鴉瓣黃酮穩定性的影響，見圖4。結果發現，老鴉瓣黃酮水溶液A372值在pH 4 ～7 之間時變化不大（P＞0.05），黃酮類化合物因分子中含有多個酚羥基，一般呈弱酸性，在此范圍內老鴉瓣黃酮較為穩定。在強酸或偏堿環境中老鴉瓣黃酮的穩定性較差（P＜0.05），因此老鴉瓣黃酮不宜在強酸或偏堿的環境中保存或使用。

圖4 pH 對老鴉瓣黃酮穩定性的影響Fig.4 Effect of pH on stability of flavonoids from Tulipa edulis

2.4.3 氧化劑H2O2對老鴉瓣黃酮穩定性的影響 于每支試管中加入1 g/L 老鴉瓣黃酮水溶液5 mL，添加H2O2，使每管中的H2O2濃度依次為0%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%（根據食品行業規定，食品中H2O2的允許含量不超過2%［15］），搖勻后在室溫下靜置1 h，按文獻［9］的方法加入試劑反應后，于372 nm波長下測定吸光度，考察氧化劑H2O2對老鴉瓣黃酮穩定性的影響，見圖5。結果發現，隨著H2O2濃度的不斷增大，老鴉瓣黃酮水溶液的A372值隨之升高，但升高不顯著（P＞0.05），表明氧化劑H2O2對老鴉瓣黃酮水溶液穩定性影響不大，進而說明了老鴉瓣黃酮具有良好的抗氧化活性［16］。

2.4.4 還原劑Na2SO3對老鴉瓣黃酮穩定性的影響 于每支試管中加入1 g/L老鴉瓣黃酮水溶液5 mL，添加Na2SO3，使每管中的Na2SO3濃度依次為0%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%（根據食品行業規定，食品中Na2SO3的允許含量不超過0.05%［15］），搖勻后在室溫下靜置1 h，按文獻［9］的方法加入試劑反應后，于372 nm 波長下測定吸光度，考察還原劑Na2SO3對老鴉瓣黃酮穩定性的影響，見圖6。結果發現，隨著Na2SO3濃度的不斷增大，老鴉瓣黃酮水溶液的A372呈下降趨勢，表明還原劑Na2SO3對老鴉瓣黃酮的穩定性有較大影響（P＜0.05），使其發生了化學變化。因此，老鴉瓣黃酮在保存或使用時需要避免接觸此類物質。

圖5 H2O2對老鴉瓣黃酮穩定性的影響Fig.5 Effect of H2O2 on stability of flavonoids from Tulipa edulis

圖6 Na2SO3對老鴉瓣黃酮穩定性的影響Fig.6 Effect of Na2SO3 on stability of flavonoids from Tulipa edulis

2.4.5 光照對老鴉瓣黃酮穩定性的影響 于每支試管中加入1 g/L 老鴉瓣黃酮水溶液5 mL，分別在密閉和自然光照射下放置，于0、1、2、3、4、5 d 時定時取樣，按文獻［9］的方法加入試劑反應后，于372 nm 波長下測定吸光度，研究光照對老鴉瓣黃酮穩定性的影響，見圖7。結果發現，隨著處理時間的延長，老鴉瓣黃酮水溶液的A372值逐漸下降，且下降趨勢為自然光大于避光條件，但均不顯著（P＞0.05），表明光照或者避光條件對老鴉瓣黃酮的穩定性影響不大。相比之下，在避光條件下老鴉瓣黃酮的穩定性稍高。

圖7 光照對老鴉瓣黃酮穩定性的影響Fig.7 Effect of illumination on stability of flavonoids from Tulipa edulis

3 結論

本試驗以老鴉瓣葉片為原料，65%乙醇為提取劑提取老鴉瓣粗黃酮，并采用D-101 大孔樹脂柱層析法對老鴉瓣黃酮進行分離純化。該提取和純化方法操作方便，成本低廉，適合于老鴉瓣黃酮的制備。

天然類黃酮化合物具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、防腐保鮮等功效，但諸多功效均受到其穩定性的影響。在不同的條件下，黃酮的穩定性具有一定的差異。本試驗研究了氧化劑H2O2、還原劑Na2SO3、光照、溫度、pH 值等因素對老鴉瓣黃酮穩定性的影響，其中Na2SO3對黃酮的穩定性影響顯著（P＜0.05），而溫度（＜85 ℃）、氧化劑H2O2、pH 4 ～7 的酸性條件以及在自然光或避光條件對黃酮的穩定性影響不大（P＞0.05）?？傊?，在試驗范圍內，老鴉瓣黃酮穩定性較高。另外本課題組研究發現，老鴉瓣黃酮具有體外抗氧化活性［7］，還具有良好的抑菌活性，因此，老鴉瓣黃酮具有一定的應用價值，值得進一步深入研究。