溞類急性毒性試驗中陽性參比毒物的篩選

郁斯貽 朱夢杰 湯琳

摘要 以硫酸鋅、硫酸鎘和苯酚作為受試毒物，以大型溞為受試生物，開展了急性毒性試驗中陽性參比毒物的篩選試驗，測定了反應24和48 h后各濃度參比毒物中大型溞的抑制率，確定硫酸鋅和硫酸鎘可作為大型溞急性毒性試驗的陽性參比毒物。硫酸鋅的24 hEC50和48 hEC50分別為3.936和2.782 mg/L，硫酸鎘的24 hEC50和48 hEC50分別為0.745和0.356 mg/L，為今后溞類毒性試驗的開展提供參考和依據。

關鍵詞 溞類;參比毒物;毒性試驗

中圖分類號 X83文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）19-0091-02doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.19.026

Abstract Using zinc sulfate， cadmium sulfate and phenol as test toxic substances， Daphnia magna was selected as subjects test organism to conduct a screening study on positive reference? toxic substances in acute toxicity test. The inhibition rates of test toxic substances? at each concentration level to D. magna after 24 and 48 hours were recorded. And the results showed zinc sulfate and cadmium sulfate could be used as positive reference toxic substances for the acute toxicity tests of daphnia. 24 h EC50 and 48 h EC50 of zinc sulfate to D. magna were 3.936 and 2.782 mg/L respectively. 24 h EC50 and 48 h EC50 of cadmium sulfate to D. magna were 0.745 and 0.356 mg/L respectively. This research provided reference and basis for conducting the? toxicity tests of daphnia in the future.

Key words Daphnia;Reference toxic substance;Toxicity tests

隨著我國經濟的快速發展和產業結構的調整，環境問題也日益突出，搬遷或廢棄的工業、農業污染場地數量呈現不斷上升的趨勢[1-2]。這些遺留的場地存在較為嚴重的污染隱患，若不進行有效的管理和修復，它們將會對土壤、地表水、地下水和周邊的環境造成危害。目前的場地污染調查以化學分析為主，但化學方法較難直觀、全面地反映各類有毒有害物質對環境或生物體的綜合影響。生物毒性試驗可以彌補這方面的不足，能夠直觀地反映污染場地的綜合生態毒性，監測復雜污染物對環境所產生的綜合效應[3-4]，為進一步的場地污染風險評估提供數據支持。

溞類是甲殼動物枝角類的統稱，隸屬節肢動物門，體短，呈卵圓形，左右側扁。溞類在淡水中分布較廣，在海水中也有少量的分布。溞類具有繁殖速度快、生活周期短、來源廣、易培養等特點，且對毒性物質敏感，因而很多國家使用溞類開展生物毒性研究[5]。Biesinger等[6]對無機汞和有機汞對大型溞的慢性毒性進行了研究。潘力軍等[7]使用大型溞對工業廢水和生活污水開展毒性監測。楊燦等[8]研究了氯霉素對溞類的急性和慢性毒性效應。

在農業和工業場地調查方面，目前也已經有一些學者開展了相關的生物毒性試驗。但是，國內外有關溞類毒性實驗中質控實驗所選用的參比毒物報道很少。ISO 6341：2012《水質—大型水蚤（甲殼綱、枝角目）活動抑制的測定》中以重鉻酸鉀為參比毒物，規定其24 h EC50為0.6～2.1 mg/L[9]。國內有許多學者發現僅僅使用重鉻酸鉀測定溞敏感性的方法過于簡單，且實際測定出的24 h EC50值偏小[10]。參比毒物是生物毒性試驗中重要的質控措施 ，因此對溞類參比毒物的篩選研究是非常有必要的。

筆者對硫酸鋅、硫酸鎘和苯酚3種毒性物質開展了溞類急性毒性試驗，并對這3種物質是否可作為溞類毒性試驗的陽性參比毒物進行了研究，旨在為今后的農用地和工業用地場地調查中溞類毒性試驗的開展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

受試生物大型溞（Daphnia magna），購自中國科學院武漢水生生物所淡水庫，經筆者所在實驗室保種培養，表觀健康。急性毒性試驗所用的大型溞是經實驗室培養的同一健康親溞孤雌生殖3代以上的幼溞，溞齡不超過24 h，幼溞個體健康、體型均勻。試驗使用經曝氣的自來水對大型溞進行預培養，培養期間每天滴加少量小球藻補充餌料。母溞的培養時間為7～10 d，培養溫度為18～22 ℃，光暗比為10? h∶14? h，光照強度為1 000～1 500 lx。急性毒性試驗期間不進行喂食。

小球藻（Chlorella vulgaris），購自中國科學院武漢水生生物所淡水庫，在保種培養期間用于喂食大型溞。

試驗所用的參比毒物硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）、硫酸鎘（CdSO4·8/3H2O）、苯酚（C6H5OH）、乙醇均購自中國國藥集團化學試劑有限公司，為分析純。

主要儀器為光照培養箱（BIC-400），為上海博迅醫療生物儀器股份有限公司產品等。

1.2 試驗方法

1.2.1 大型溞的培養方法。

將購置的懷卵大型溞在室溫下（18～22? ℃）置于500 mL經曝氣的自來水中進行單獨培養，培養期間每天滴加少量小球藻補充餌料。母溞的培養時間為7～10 d，在自然光照條件下進行培養。第1代幼溞轉移至1 000 mL經曝氣的水中繼續培養，以獲得純種的第2代幼溞。將第2代幼溞轉移至2 000 mL經曝氣的水中進行培養，獲得純種的第3代幼溞作為試驗用溞。第1代和第2代幼溞的培養條件均同母溞。

1.2.2 參比毒物的配制。

選用硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）、硫酸鎘（CdSO4·8/3H2O）、苯酚（C6H5OH）作為參比毒物。以無菌水為溶劑，配制濃度10? g/L的硫酸鋅和硫酸鎘溶液母液以及濃度1 g/L的苯酚溶液母液。由于苯酚在常溫條件下溶解度小，因而在配制苯酚溶液時添加少量的無水乙醇作為助溶劑。在進行預試驗和正式的急性毒性試驗時，可根據試驗需求將配制好的母液稀釋至一定濃度后使用。

1.2.3 預試驗。

在進行溞類急性毒性試驗前，先做預試驗，設置間隔較大的4個濃度，從而確定正式急性毒性試驗各參比毒物的濃度范圍。預試驗設置的4個濃度分別為100.0、100、10、0.1 mg/L，同時設置空白對照，苯酚組增設助溶劑對照，其助溶劑用量同最高濃度組（100 mg/L）。每種參比毒物每個濃度的燒杯中放入5只經實驗室培養的幼溞，不設置平行組。預試驗在室溫（18～22 ℃）、自然光照條件下進行。試驗期間不進行喂食和更換試驗溶液。試驗開始后24和48 h，分別觀察并記錄大型溞的活動抑制情況。

1.2.4 急性毒性試驗。

根據預試驗結果，在各參比毒物對大型溞急性活動完全不抑制的最高濃度和100%完全抑制的最低濃度范圍內以幾何級數設置濃度系列，同時設置空白對照。每個濃度設置4組平行，每組試驗燒杯中放入5只幼溞。試驗條件和方法同“1.2.3”。試驗開始后24和48 h分別觀察并記錄大型溞的活動抑制情況。

2 結果與分析

2.1 預試驗結果

由表1可知，ZnSO4·7H2O在24和48 h內對大型溞無活動抑制（24 h EC0、48 h EC0）的最高濃度均為1 mg/L，100%活動抑制（24 h EC100、48 h EC100）的最低濃度均為10 mg/L。CdSO4·8/3H2O對大型溞24 h EC0、48 h EC0的最高濃度均為0.1 mg/L，24 h EC100、48 h EC100的最低濃度分別為10和1 mg/L。C6H5OH對大型溞24 h EC0、48 h EC0的最高濃度均為10? mg/L，24 h EC100、48 h EC100的最低濃度均為100? mg/L。

2.2 急性毒性試驗結果

急性毒性試驗結果見表2。采用SPSS Stastistics 17.0中的Logit模型對數據進行概率單位回歸分析。以各參比毒物試驗濃度的對數值為橫坐標，以抑制率為縱坐標，繪制回歸曲線，得到線性回歸方程y=Bx+A、皮爾遜擬合優度卡方檢驗顯著水平、24 h EC50、48 h EC50和95%置信區間?；貧w分析結果見表3。

由表3可知，ZnSO4·7H2O和CdSO4·8/3H2O 24 h和48 h的皮爾遜擬合優度卡方檢驗的P值均大于0.05，說明這2種參比毒物的試驗數據擬合度較好，且ZnSO4·7H2O和CdSO4·8/3H2O具有方便易得、性質穩定等特點，因而是大型溞急性毒性試驗較為理想的陽性參比毒物。C6H5OH 48 h數據組的皮爾遜擬合優度卡方檢驗的P值小于0.05，說明苯酚的試驗數據擬合度較差，且苯酚在常溫條件下微溶于水，實際操作時需添加少量乙醇作為助溶劑，操作較為復雜，因而不宜作為陽性參比毒物。

3 討論與結論

該試驗是以大型溞作為受試生物開展的急性毒性試驗，試驗結果僅適用于大型溞。在實際開展溞類毒性試驗時，還可以選用蚤狀溞、隆線溞等對毒性物質敏感的其他溞種。由于不同品種的溞類對各毒物的敏感性不盡相同，所以在選擇其他品種的溞類作為受試生物開展研究時，需要進一步驗證硫酸鋅和硫酸鎘是否適合作為其陽性參比毒物。

硫酸鋅、硫酸鎘是實驗室較為常見的化學品，具有性質穩定、方便易得的特點。經大型溞急性毒性試驗發現，ZnSO4·7H2O、CdSO4·8/3H2O對大型溞的24 h EC50分別為3.936和0.745? mg/L，48 h EC50分別為2.782和0.356? mg/L，且數據擬合度較好，可作為大型溞急性毒性試驗的參比毒物。苯酚對大型溞的急性毒性試驗數據擬合度較差，不適合作為大型溞急性毒性試驗的陽性參比毒物。

參考文獻

[1] 周友亞，顏增光，郭觀林，等.污染場地國家分類管理模式與方法[J].環境保護，2007（10）：32-35.

[2] HODDINOTT K B H.Superfund risk assessment in soil contamination studies：3rd volume[M].USA：ASTM International，1998：100-108.

[3] 周艷，徐建，馮艷紅，等.污染場地河道底泥浸出液對斑馬魚胚胎的毒性效應[J].生態毒理學報，2013，8（6）：963-971.

[4] 宋曉威，徐建，張孝飛，等.廢棄農藥廠污染場地淺層地下水生態毒性診斷研究[J].農業環境科學學報，2011，30（1）：42-48.

[5] 國家環境保護總局.水和廢水監測分析方法[M].4版.北京：中國環境科學出版社，2002：721.

[6] BIESINGER K E， ANDERSON L E， EATON J G.Chronic effects of inorganic and organic mercury on Daphnia magna：Toxicity， accumulation， and loss[J].Archives of environmental contamination and toxicology，1982，11（6）： 769-774.

[7] 潘力軍，高世榮，孫鳳英，等.應用大型水蚤和斑馬魚對幾種工業廢水和生活污水的毒性監測[J].環境科學與管理，2007，32（2）：180-183.

[8] 楊燦，沈根祥，胡雙慶，等.氯霉素對大型溞的急性和慢性毒性效應研究[J].生態毒理學報，2018，13（5）：248-255.

[9] International Organization for Standardization.Water qualityDetermination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus（Cladocera， Crustacea）Acute toxicity test：ISO 6341—2012[S].Switzerland：IHS， 2012.

[10] 國家環境保護總局.水生生物監測手冊[M].南京：東南大學出版社，1993：70.