檸條木質素降解菌的篩選及其降解條件優化

崔家榮 段開紅

摘要 [目的]將檸條轉化為可被牲畜高效利用的優良飼料。[方法]采用檸條作為單一碳源的篩選培養基、苯胺藍篩選培養基從牲畜糞便以及檸條腐質中分離篩選出對檸條木質素具有降解作用的菌株D-11。[結果]經微生物形態學和16S rDNA鑒定，D-11為地衣芽孢桿菌，同時對D-11降解條件進行優化。菌株D-11的最佳降解條件如下：最佳氮源為蛋白胨;溫度為28～32 ℃;pH為7;添加誘導劑Mn2+的濃度為0.6 mmol/L。在最優條件下，菌株D-11對檸條木質素降解率為18.21%，半纖維素的降解率為16.11%，纖維素的降解率為13.19%。[結論]采用菌株D-11對檸條進行發酵降解，使其轉化為可被牲畜利用的優良飼料。

關鍵詞 檸條;木質素;木質素降解菌;篩選;發酵降解;降解條件優化

中圖分類號 S816.6文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）19-0107-03doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.19.031

Abstract [Objective] To convert Caragana korshinskii into a good feed efficiently utilized by livestock.[Method]C.korshinskii was used as a single carbon source for screening medium and aniline blue screening medium was used to separate and screen out lignin degrading strain D11 from livestock manure and C.korshinskii humus.[Result] Strain D11 was identified by microbial morphology and 16S rDNA as Bacillus licheniformis，and the degradation conditions of D11 were optimized.The optimal degradation conditions of strain D11 were as follows：optimal nitrogen source was peptone，temperature was 28-32 ℃，pH was 7，the concentration of added inducer Mn2+ was 0.6 mmol/L.Under the optimal conditions，the degradation rate of strain D-11 to C.korshinskii lignin was 18.21%， the degradation rate of hemicellulose was 16.11%，the degradation rate of cellulose was 13.19%.[Conclusion] Strain D-11 can be used to ferment and degrade C.korshinskii，which can be transformed into an excellent feed utilized by livestock.

Key words Caragana korshinskii;Lignin;Lignindegrading bacteria;Screening;Fermentation and degradation;Optimization of degradation conditions

檸條是多年生豆科灌木，作為一種非競爭性資源，在我國北方地區具有數量大、分布廣、價格低廉的特點，由于其枝繁葉茂、營養豐富，含有10多種生物活性物質，尤其是氨基酸含量豐富[1]，因此也是良好的飼用植物，但其木質纖維素含量高，且收獲干燥后莖稈粗硬，并具有脫葉刺也成為影響牲畜對其高效利用的關鍵問題[2]。筆者從微生物豐富的糞便及其檸條腐殖質中分離篩選出具有高效降解檸條木質素的菌株，將檸條中難以被牲畜直接消化利用的木質素，通過生物處理的方式降解為可被生物利用的小分子物質，提高檸條的飼料營養價值和利用率，來發揮檸條潛在的飼用價值。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及處理方法 試驗所用樣品采自市區周邊郊區農戶的牲畜糞便、腐質檸條，分別裝入無菌袋帶回并保存于4 ℃冰箱中。

1.2 培養基

①初篩培養基。檸條粉10 g（檸條磨粉，過40目篩，65 ℃烘16 h），NH4NO3 1.0 g，K2HPO4 0.5 g，KH2PO4 0.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4 0.2 g，CaCl2 0.2 g，微量MnSO4·H2O，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 L。②基本培養基（BM）。酵母膏10 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1L。③苯胺藍篩選培養基。配制濃度為1.0%的苯胺藍（Azure-B）母液，在制作平板時，每100 mL 基本培養基（BM）中加入1.0 mL 母液即可。④LB培養基。胰蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L。⑤液體發酵培養基。檸條粉10 g，蒸餾水1 L，自然pH，121 ℃滅菌30 min。

1.3 方法

1.3.1 降解木質素菌的篩選。

1.3.1.1 初篩。分別稱取各樣品10 g，搗碎后無菌水振蕩活化12 h，取上清液稀釋成10-4、10-5、10-6 濃度梯度的稀釋液，取0.1 mL 涂布到初篩培養基平板上，置于30 ℃恒溫箱中恒溫培養1～3 d，挑取能夠在初篩培養基上生長的細菌菌株在LB 培養基上進行劃線分離、純化，最后保存在LB 斜面培養基上。

1.3.1.2 復篩。將初篩得到的菌株擴培，轉接到BM培養基中，置于37 ℃恒溫培養48 h后，每株菌做2個平行。10 000 r/min、4 ℃離心5 min，取上清液點樣于Azure-B 平板的微孔，每孔點樣100 μL。37 ℃避光培養2 d后，觀察并記錄脫色圈的有無及大小。

1.3.2 木質素酶活力的測定方法。因為所篩菌株未檢測漆酶活性，所以僅對木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶進行測定。制得菌株粗酶液后，按照Klopman等[3]和Heinfling等[4]的測定方法分別對木質素過氧化物酶（Lip）和錳過氧化物酶（Mnp）活力進行測定。

1.3.3 菌株液體發酵培養。

將保存在LB斜面上的菌株轉接到LB液體培養基中活化培養后，轉接到液體發酵培養基中，以10%的接種量接種于液體發酵培養基中，30 ℃下恒溫振蕩培養15 d。

1.3.4 檸條發酵產物中木質纖維素各組分含量的測定。

發酵產物在121 ℃下滅菌30? min，過濾后收集殘渣，并在烘箱中55? ℃ 烘干至恒重，參照Van Soest等[5]的木質纖維素測定方法對檸條發酵物中的木質素、纖維素和半纖維素含量進行測定，以未發酵檸條粉為對照，計算出檸條中各組分的相對降解率。以上試驗重復3次。

1.3.5 菌種鑒定。

將分離純化的菌株在LB液體培養基中培養3～5 d。利用引物27F和1492R擴增所篩選微生物16S rDNA，送交測序公司測序后，將序列與NCBI網站登錄序列進行比對。根據比對結果及形態特征確定所篩選菌株的種屬。

2 結果與分析

2.1 降解木質素菌株的篩選

從樣品中共分離到木質素降解菌31株，采用苯胺藍平板法初篩到具有水解透明圈的菌株12株。選取初篩菌株中水解圈直徑較大的前5株菌株進行液體發酵，測定發酵上清液的水解圈大小，同時結合木質素降解酶活力的測定結果進行復篩（表1）。從表1可以看出，以上菌株在發酵培養基上產酶活力以菌株D-11、Y-1、S-3 較高。選取D-11 菌株進行種屬鑒定及后續研究。

2.2 菌株D-11的16S rDNA 序列分析及系統發育樹分析

將木質素降解菌株D-11的16S rDNA序列經測序獲得的序列在NCBI網站中進行BLAST搜索和序列比對，結果顯示所獲得序列的同源性很高的序列大多來自芽孢桿菌屬（Bacillus）。根據16S rDNA序列比對結果以及系統發育樹的遺傳距離分析（圖1），初步鑒定菌株D-11為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis strain）。

2.3 D-11菌株對檸條木質素的降解率測定

對未發酵檸條粉和發酵15 d后檸條粉中木質素、纖維素和半纖維素含量進行測定，結果見圖2。從圖2可以看出，檸條粉經菌株D-11發酵15 d后，對木質素的降解率最高，達到10.12%;半纖維素和纖維素的降解率分別為9.63%和7.37%。這說明D-11對檸條木質纖維素中各組分均具有一定的降解能力，尤其以木質素的降解能力最好，與纖維素和半纖維素相比降解效果最為明顯。

2.4 木質素降解條件的優化

2.4.1 氮源的影響。

以檸條固定碳源，為發酵培養基中分別添加0.05%尿素、蛋白胨、硫酸銨以及硝酸鈉作為不同的氮源，接種D-11培養15 d后測定其各木質素降解率，結果見表2。從表2可以看出，選取的4種氮源中，D-11菌株對蛋白胨的利用較好，其降解能力較其他氮源總體上有所提升，使用硫酸銨以及硝酸鈉為氮源是對于木質素降解率的提高不大，而以尿素為氮源時，其降解能力均有一定程度的下降。因此，蛋白胨為菌株D-11的適宜氮源。

2.4.2 溫度的影響。

從圖3可以看出，各組分降解能力所對應的最適溫度范圍比較寬泛。木質素與纖維素降解的最適溫度為32 ℃，但纖維素的降解在28～35 ℃內變化不大;半纖維素的最適降解溫度為28 ℃，但在升溫至32 ℃過程中木質素降解率的下降幅度并不大。各組分的降解能力在超過36 ℃時有明顯下降，究其原因可能是溫度的升高使降解酶的酶活發生變化，從而降低了木質素的降解率。

2.4.3 pH的影響。

木質素降解能力受培養液pH的影響較大。從圖4可以看出，當培養液的pH為7時，木質素、纖維素與半纖維素的降解能力均達到峰值。這說明中性環境對于D-11的產酶以及木質素的降解更為有利，過高或者過低的pH都可能使菌株的生長發育產生了一定的消極影響，同時極端pH也會使降解所需酶失活變性，從而影響了木質素的降解效率。D-11對于木質素的降解在pH 為7時達到1293%，而纖維素的降解率在pH為6～8時變化幅度不大。

2.4.4 Mn2+濃度的影響。

菌株D-11的所產Mnp的酶活相對于S-3較弱，同時Mnp活性較為依賴Mn2+的濃度，所以添加一定濃度的Mn2+可以提高Mnp的活力，從而提高木質素的降解能力。從圖5可以看出，木質素與纖維素降解率隨Mn2+濃度的增加而升高，但當Mn2+濃度低于0.8 mmol/L時對木質素與纖維素的降解有一定的促進作用，但對半纖維素降解的影響較小，當Mn2+濃度大于0.8 mmol /L 時菌株D-11對木質纖維素的降解能力整體呈下降趨勢。這說明過量的Mn2+可能會變成毒性離子，會影響菌株的正常生長，將促進作用轉變為抑制作用。

3 討論

目前，木質素的生物質降解利用主要集中在真菌與復合菌劑的研究，然而真菌雖然在降解效果上較為理想[6]，但其培養周期長，保存運輸不便以及在飼料青貯過程中容易引起飼料變質等問題也限制了其在生物質降解利用方面的推廣。在針對木質素降解菌的研究中發現許多可以降解木質素的細菌，Bugg等[7]與Tuomela等[8]從造紙廠廢水中篩選出幾株芽孢桿菌，并在其細胞提取物中都分離出活性較高的木質素降解酶。另外，Bandounas等[9]也成功分離出幾株可以降解堿性卡夫木質素的芽孢桿菌。這些研究結果表明芽孢桿菌可能是木質素降解中起到關鍵作用的微生物。該研究通過篩選成功分離到一株具有單獨降解檸條木質素能力的地衣芽孢桿菌D-11，這對于檸條木質素降解的研究具有一定的理論指導意義。

該研究采用單因素試驗對氮源、溫度、pH以及誘導劑等影響木質素降解的主要因素進行優化，從而提高菌株D-11 對3種生物質的降解能力， 在優化條件下菌株D-11對檸條木質素發酵15 d的降解率為18.21%，低于李紅亞等[10]采用細菌液態發酵玉米秸稈16 d后24% 的木質素降解率。篩選菌株的木質素降解率較低可能是由于多年生的平茬檸條木質化程度高，遠遠大于一般作物秸稈中的木質素含量，使相比更一般作物秸稈更難被降解;同時，該研究僅對部分發酵條件進行優化，可能未達到菌株的最佳發酵條件。王仁佑等[11]研究表明金屬離子添加可以促使微生物的生長而提高產酶量，而且可以通過添加表面活性劑改變菌株細胞膜的通透性來提高胞外酶的分泌，促使微生物酶活的增加，提高木質素降解能力[12]。因此，該研究下一步的研究重點是繼續優化發酵培養條件，考量其他誘導劑以及表面活性劑對菌株產酶和降解能力的影響，同時會研究多種微生物分部處理的生物預處理方法，加快降解速率并側重于實現木質素的選擇性降解，從而達到檸條纖維素回收利用的目的，提高發酵飼料的營養價值。

4 結論

從檸條作為唯一碳源的篩選培養基和苯胺藍篩選培養基中分離出木質素降解菌株D-11，經過16S rRNA序列分析鑒定為地衣芽孢桿菌，對其采用優化的降解條件：氮源為蛋白胨;溫度28～32 ℃;pH 為7;添加Mn2+的濃度為0.6 mmol/L進行檸條發酵，其木質素降解率為18.21%，半纖維素的降解率為16.11%，纖維素的降解率為13.19%，其中木質素降解率較優化前提高了79.94%。該研究結果為后續對檸條木質素的降解研究提供更多試驗依據。

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