離子色譜法測定銀耳湯中的硝酸鹽和亞硝酸鹽

林淼 白冰 時文興

摘要 [目的]建立銀耳湯中硝酸鹽和亞硝酸鹽的離子色譜測定方法。[方法]銀耳樣品經純水蒸煮提取，3%乙酸沉淀蛋白質后，低溫離心，上清液依次過C18小柱、Ag柱、Na柱，經濾膜過濾凈化后，由電導檢測器檢測樣品中的硝酸鹽和亞硝酸鹽含量。[結果]硝酸鹽（以NO3-計）和亞硝酸鹽（以NO2-計）分別在0.2～2.0和0.02～0.20 mg/L呈良好的線性關系，決定系數R2均大于0.999 6。該方法硝酸鹽和亞硝酸鹽檢出限分別為0.4和0.2 mg/kg，硝酸鹽的回收率為89.8%～96.1%，亞硝酸鹽的回收率為85.1%～95.3%。[結論]該方法結果準確可靠，可以用于銀耳湯中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量測定。

關鍵詞 銀耳湯;離子色譜法;硝酸鹽;亞硝酸鹽

中圖分類號 TS207.3文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）19-0209-03

Abstract [Objective] The research aimed to establish an ion chromatographic method for the determination of nitrate and nitrite in tremella soup.[Method] After cooking with pure water，protein precipitation using 3% acetic acid，and centrifugaion at low temperature，the supernatant was filtered through C18 column，Ag column and Na column for injection analysis.And then it was analyzed by ion chromatogrephy，and the conductivity dectector was used to detect nitrate and nitrite in tremella soup.[Result] Nitrate （calculated as NO3-） and nitrite （calculated as NO2-） showed good linearity at 0.2-2.0 and 0.02-0.20 mg/L，respectively，and the determination coefficient R2 was greater than 0.999 6.This method detection limit was 0.4 mg/kg for nitrate and 0.2 mg/kg for nitrite.The recovery rate of nitrate was 89.8%-96.1%，and the recovery rate of nitrite was 85.1%-95.3%.[Conclusion] This method is accurate and reliable，and suitable for determination of nitrate and nitrite in tremella soup.

Key words Tremella soup;Ion chromatogrephy method;Nitrate;Nitrite

硝酸鹽和亞硝酸鹽是2種經常使用的食品添加劑，在肉制品加工業中常被用作發色劑，可以使其保持良好的色澤，并起到一定的防腐和增強食品風味的功效。即使沒有人工添加，蔬菜在生長過程中也容易富集硝酸鹽[1]。大量攝入硝酸鹽可使人中毒，如搶救不及時會危及生命。同時，硝酸鹽通過唾液、胃和血管還原成亞硝酸鹽[2]，亞硝酸鹽的含量主要受硝酸鹽含量的影響[3]。亞硝酸鹽在人體內外與仲胺類作用可形成亞硝胺類物質，當其在人體內達到一定計量時，就會對人體產生致癌、致畸、致突變的危害[4]。研究發現，攝入硝酸鹽含量較高的食物會增加人們患乳腺癌、腸胃癌、高鐵血紅蛋白癥等疾病的概率[5-7]。當患有胃腸道疾病或者胃酸過少時，胃腸道內的細菌會把硝酸鹽還原成亞硝酸鹽而導致中毒，就是人們常說的“腸原性紫紺癥”[8]。

銀耳又名白木耳、血耳，為銀耳科植物銀耳的子實體。銀耳有菌中之冠的美譽，性味甘平，含有天然植物性膠質多糖，可以長期服用，具有補腎潤肺、生津止咳、強心健腦、滋陰養胃、益氣和血、增強免疫功能之功效[9-11]。由于銀耳是一類營腐生生長的真菌，因腐生質中含有豐富的氮源（硝酸鹽類），在該基質上生長時，造成銀耳不可避免地會富集大量的硝酸鹽[12]。銀耳煮湯后，隨著放置時間的增長，湯中富集的亞硝酸鹽也會增多，因此，有必要建立一種準確快速的檢測方法，用于銀耳湯中硝酸鹽和亞硝酸鹽的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀耳（Tremella fuciformis）干樣購自某電商。OnGuard ⅡAg柱（1? mL）、OnGuard ⅡNa柱（1? mL），賽默飛世爾科技（中國）有限公司;冰醋酸（色譜純），西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司;50%～52%氫氧化鈉溶液，美國Fluka公司;硝酸根離子（NO3-）標液（1 000 mg/L，水基體）、亞硝酸根離子（NO2-）標液（1 00 mg/L，水基體）均購自上海市計量測試技術研究院;分析中所用水均為超純水（>18 MΩ·cm）;C18小柱（3? mL/500 mg），上海安譜實驗科技股份有限公司;10? mL注射器，岳陽明康醫用材料有限公司;0.22 μm水性濾膜，天津津騰實驗設備有限公司。

1.2 主要儀器

離子色譜ICS3000，美國Dionex公司，配備四元梯度泵和電導檢測器、陰離子抑制器;Chromeleon 6.7 色譜工作站; ST16R型冷凍高速離心機，Therom公司;AL204-IC型電子天平，梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司; C21-WK2102型電磁爐及鍋具，美的集團;ELGA型超純水儀，PURELAB Ultra公司。

1.3 溶液配制

淋洗液：移取50%氫氧化鈉5.2? mL，用去離子水溶解至1 L，此濃度為100 mmol/L。乙酸溶液（3%）：量取乙酸3 mL于100 mL容量瓶中，以水稀釋至刻度，混勻。

亞硝酸鹽和硝酸鹽混合標準使用液：移取亞硝酸鹽和硝酸鹽混合標準溶液，加水逐級稀釋，制成系列混合標準使用液，亞硝酸根離子濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/L;硝酸根離子濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、15、2.0 mg/L;該溶液臨用現配。

1.4 色譜條件

陰離子交換色譜分析柱為Dionex IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm（帶IonPac AG11-HC型保護柱 4 mm×50 mm），柱溫30 ℃;進樣體積25 μL;淋洗液：氫氧化鈉溶液，濃度為6～70 mmol/L;洗脫梯度為6 mmol/L 30 min，70 mmol/L 5 min，6 mmol/L 5 min;流速1.0 mL/min。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理方法的選擇

由于銀耳干樣吸水量很高，如果稱樣量較大會導致無法提取銀耳湯溶液，而且銀耳多糖含量較高，經高溫蒸煮后的溶液較黏稠，同時銀耳中營養物質豐富，干擾較多，雜質會干擾目標峰，而稱樣量過小則達不到檢測要求的靈敏度，因此選擇合適的稱樣量對試驗有很大的影響。研究考察了10.0、20.0、40.0、80.0和100.0 g這5個稱樣量，對比不同稱樣量樣品的色譜圖，參考峰形、靈敏度和基線，結果顯示稱樣量40.0 g效果最佳。

2.2 沉淀劑的選擇

去除蛋白質一般是采用有機溶劑、酸沉淀、加熱變性或者用重金屬沉淀等方法。由于銀耳樣品的基質復雜，在使用有機溶劑進行沉淀時，雜質物質也會在過C18小柱時同時洗脫，不易凈化。使用加熱變性法不適用于銀耳，因為該方法很容易造成銀耳糊化變性，沉淀效果不好。使用重金屬沉淀，常用的有亞鐵氰化鉀和乙酸鋅，則會引入大量鋅、鉀、鐵等金屬離子污染色譜柱，使離子色譜柱效降低，壽命縮短。試驗表明，采用3%的乙酸沉淀蛋白質效果最好，雜質峰相對較少。

2.3 樣液分離及初步凈化

由于銀耳湯樣品較黏稠，高溫易糊化，不能采用濾紙過濾的方法。為方便進行批量操作，該試驗采用50? mL離心管進行沉淀，低溫離心分離樣液。上清液依次過C18小柱、Ag柱、Na柱進行凈化。其中Ag柱主要去除Cl-，避免過濾的Cl-干擾亞硝酸鹽的檢測。

2.4 標準曲線、檢出限及定量限

由表1可知，硝酸鹽在0.2～2.0 mg/L、亞硝酸鹽在0.02～0.20 mg/L濃度與峰面積的線性良好，硝酸鹽和亞硝酸鹽的方法檢出限分別為0.4和0.2 mg/kg，定量限分別為1.2和0.6 mg/kg。由圖1可知，硝酸鹽和亞硝酸鹽在26 min內可以實現完全分離，硝酸鹽和亞硝酸鹽色譜峰分離度良好，能夠進行準確的定量分析。應用此方法對銀耳湯實際樣品進行檢測，結果令人滿意，如圖2～3所示。

2.5 精密度、重復性和回收率

按上述優化后的條件制備銀耳溶液，連續進樣6次，硝酸鹽和亞硝酸鹽的相對標準偏差（RSD）均小于5%，分別平行稱取6份銀耳湯樣品，依次進樣分析，硝酸鹽和亞硝酸鹽峰面積的RSD均小于10%，表明方法精密度、重復性良好。

由表2可知，向銀耳湯樣品中分別添加不同水平的硝酸鹽和亞硝酸鹽，回收率為81%～101%，表明回收率良好。

2.6 樣品測定結果

為貼近實際生活需要，該試驗設計采用3種不同蒸煮操作方案、2種保存方式（室溫20 ℃和冷藏4 ℃）。試驗結果發現（表3），用去離子水處理過的銀耳湯中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量均較低，且在室溫和冷藏條件下，隨著保存時間的增加并無明顯變化。用自來水煮的銀耳湯無論是否加入冰糖，其硝酸鹽和亞硝酸鹽含量均顯著高于用去離子水煮的銀耳湯，并且隨著保存時間的延長，硝酸鹽含量呈逐步下降的趨勢，亞硝酸鹽含量逐步上升。同樣用自來水煮后保存相同的時間，室溫儲存條件下亞硝酸鹽的增加幅度明顯高于冷藏保存條件;用自來水煮的過程中加入冰糖，在室溫保存條件下保存48 h，其亞硝酸鹽含量增加特別明顯。根據該試驗的結果，建議在煮銀耳時盡量現煮現喝，不要過長時間保存;如果因為各種原因需要保存一段時間食用，也需要冷藏保存，盡量先不要加冰糖，在需要食用時加熱過程中再加入冰糖;如果條件允許，可以使用純凈水煮銀耳，可以有效防止亞硝酸鹽的生成。

3 討論

隨著人們生活水平的提高，人們對飲食的營養成分以及食品安全都倍加重視，銀耳由于其具有很高的藥用價值而受到大家的喜愛。如何健康食用銀耳、減少危害是人們最為關心的內容。該方法采用離心分離樣液，并過C18小柱，解決了樣品前處理液黏稠及過濾后樣液不澄清等技術問題。結果表明，該試驗采用的方法操作簡便高效、準確度高、數據重現性好，適用于大批量銀耳中硝酸鹽和亞硝酸鹽的測定，對銀耳的質量控制和指導普通市民食用銀耳具有重大意義。

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