黃酒和米酒中氨基酸態氮測定方法的比較

王斯維，王棟，陶玲玲，徐巖

(江南大學 生物工程學院，教育部工業生物技術重點實驗室，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

在釀造酒行業中，氨基酸不僅能賦予釀造酒鮮、甜、苦、澀等多種味覺特征，同時還為發酵過程中酵母等微生物的生長代謝提供氮源，促進發酵作用[1-3]，因此氨基酸含量水平是食品發酵工業中一個重要的指標[4]。氨基酸水平通常以氨基酸態氮進行表征，以衡量原料蛋白質的水解程度、發酵液的氮源水平及產品質量等。

在食品發酵領域，氨基酸態氮的常用測定方法是甲醛滴定法和茚三酮比色法。甲醛滴定法常用于黃酒、醬油等產品中氨基酸態氮的測定[5-6]，該方法通過甲醛結合氨基，使氨基酸顯酸性，進而通過標準NaOH溶液對其進行定量。甲醛滴定法雖然操作簡單，但甲醛為一類致癌物[7]，且該方法檢測限較高[8]，常用于對氨基酸含量較高的產品進行檢測。茚三酮比色法是啤酒等產品中氨基酸態氮的測定方法[9-10]，也常用于測定茶葉等食品中游離氨基酸總量[11]，是一種操作方便、重現性和準確度都比較高的分析方法。此外，氨基酸的分析也可通過基于色譜技術的氨基酸分析儀，利用衍生物質與氨基酸的結合來實現氨基酸分析，該方法能準確定量樣品中近20種常見的游離氨基酸，但是成本較高，操作較為繁瑣[12]。已有研究比較了甲醛滴定法與茚三酮比色法對特定產品中氨基酸態氮的測定[8, 13]，結果表明，這2種方法均具有較高的準確度和精密度，但測定結果有一些差異。此外，茚三酮比色法雖然不能檢測脯氨酸等氨基酸，但相對于甲醛滴定法，其檢測限更低，測定濃度范圍更廣[8]?？傮w而言，2種方法各有優缺點，對于不同的測定目的，應選擇合適的測定方法。

目前黃酒中氨基酸態氮的測定在國際上采用的是甲醛滴定法[5]。但是，近年來清爽型黃酒以及米酒逐漸受到市場的歡迎，而這些產品中氨基酸含量相對較低，利用甲醛滴定法測定某些清爽型黃酒，測定結果誤差可能相對較大。特別是一些米酒產品，利用酒藥(小曲或米曲)而不是麥曲作為糖化發酵劑進行釀造，氨基酸含量相對更低，甲醛滴定法是否可以準確地測定其中的氨基酸態氮含量，成為目前出現的問題。

本研究通過對黃酒和米酒中氨基酸態氮不同測定方法的比較，重點探討了茚三酮比色法在米酒和黃酒等中國傳統釀造酒中的適用性，為米酒行業中氨基酸態氮分析指標的建立提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

本研究所用黃酒和米酒樣品均為市售商品或由生產廠家提供的產品，包括9個黃酒樣品和8個米酒樣品，共17個。產地來源以浙江、江蘇、上海和湖北為主，產品類型涉及干、半干、半甜和甜型等各種類型，酒精度范圍為5%～18%vol。

1.1.2 實驗試劑

甲醛水溶液、乙醇、酚酞、NaOH、鄰苯二甲酸氫鉀、Na2HPO4、KH2PO4、水合茚三酮、果糖、碘酸鉀、甘氨酸四氫呋喃、三乙胺、鹽酸、結晶乙酸鈉、三氯乙酸：分析純，上海國藥集團；甲醇、乙腈：色譜純，美國TEDIA公司；17種氨基酸標準品，Sigma公司。

1.2 儀器與設備

FE20型pH計，瑞士Mettler Toledo；CYTATION3型酶標儀，BioTek公司；Centrifuge 5810R型高速離心機，德國Eppendorf公司；Agilent1100型高效液相色譜儀系統，美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酒樣處理

取酒樣40 mL于50 mL離心管中，4 ℃下8 000 r/min離心5 min后，取上清作為實驗試樣，存放于4 ℃冰箱備用。

樣品酸度調節：先以0.5 mol/L的NaOH溶液對樣品進行中和處理，調節樣品pH至8.20，然后添加適量乳酸調節處理后的樣品，達到所需的總酸含量(以乳酸計)。

樣品乙醇濃度調節：利用旋轉蒸發儀在40 ℃、100 hPa壓力下對酒樣進行減壓蒸餾處理0.5～1 h去除乙醇，然后加入適量無水乙醇調節處理后樣品中的乙醇含量至所需要的水平。

1.3.2 測定分析方法

甲醛滴定法參照黃酒國標GB/T 13662—2018[5]。

茚三酮比色法參照啤酒工業手冊[9]并略加改進。將酒樣稀釋100倍后取稀釋酒樣2.00 mL，置于10 mL離心管中，加顯色劑1.00 mL，搖勻，在恒沸水浴中準確加熱16 min后，于20 ℃水浴中冷卻20 min，加5 mL KIO3稀釋溶液，搖勻，用酶標儀于570 nm波長處測定其吸光度(OD值)。標準曲線制作：用不同濃度的甘氨酸標準溶液(濃度范圍為1.60～53.57 mg/L)進行上述操作測定吸光度后繪制標準曲線。

氨基酸分析儀采用OPA柱前衍生反相高效液相色譜-紫外檢測法[14]。樣品處理：樣品經三氯乙酸沉淀后靜置0.5 h，取上清過0.22 μm有機微孔濾膜，濾液進樣。色譜條件：色譜柱為Agilent Hypersil ODS柱，流動相A為27.6 mmol/L醋酸鈉-三乙胺-四氫呋喃(體積比為500∶0.11∶2.5)，流動相B為80.9 mmol/L醋酸鈉-甲醇-乙腈(體積比為1∶2∶2)，采用梯度洗脫，洗脫程序為：0 min，8%B；17 min，50%B；20.1 min，100%B；24.0 min，0%B；流動相流速為1.0 mL/min；柱溫為40 ℃；紫外檢測器(VWD)檢測波長為338 nm，其中脯氨酸在262 nm波長下檢測。

氨基酸態氮計算。根據氨基酸分析儀測得的各氨基酸含量及其所含的氨基酸態氮、α-氨基酸態氮分別進行換算得到總氨基酸態氮和α-氨基酸態氮含量。

2 結果與分析

2.1 黃酒和米酒特性對茚三酮比色法測定氨基酸態氮的影響

茚三酮比色法是啤酒行業中氨基酸態氮測定的標準方法[9-10]。與啤酒相比，黃酒和米酒在一些特性上存在著較大差異，如黃酒色澤較深，乙醇和總酸含量遠高于啤酒等，因此，首先對黃酒和米酒的這些特性是否會影響茚三酮比色法的測定結果進行了探究。

2.1.1 色澤對茚三酮比色法測定的影響

茚三酮比色法較為靈敏，在測定啤酒樣品時需要進行100倍左右的稀釋[15]。黃酒酒液由于顏色較深，可能會對茚三酮比色法的結果產生干擾[16]。因此，參考啤酒樣品的處理方法，首先對黃酒和米酒樣品進行100倍稀釋處理，對稀釋前后的所有樣品在400～700 nm之間進行全波長掃描，主要對各樣品570 nm波長處測定的OD值進行分析，考察黃酒和米酒色澤是否對茚三酮比色法的測定有影響。結果如圖1所示，黃酒樣品在570 nm處的OD值平均在0.20左右，高的可達0.35，而米酒樣品的OD值相對較低。由于比色法需要對樣品進行稀釋處理，在稀釋100倍后，黃酒和米酒樣品的OD值均降低至0.037～0.041，與純水的吸光度接近，因此可以認為黃酒和米酒的色澤在茚三酮比色法的測定中不會對測定結果產生明顯影響。

2.1.2 總酸對茚三酮比色法測定的影響

黃酒或米酒中總酸(以乳酸計)一般在10 g/L以下，隨機選取黃酒和米酒樣品各1個，調節樣品中的總酸含量為0 ～20 g/L，利用茚三酮比色法測定不同酸度下樣品的氨基酸態氮。結果如表1所示，不同酸度對2個樣品中比色法測定值的相對偏差基本小于3.00%，最高為5.19%，因此可以認為黃酒或米酒的酸度不會對茚三酮比色法的測定結果產生明顯影響。

A-黃酒稀釋前的OD值；B-米酒稀釋前的OD值；C-黃酒稀釋后的OD值；D-米酒稀釋后的OD值；E-570 nm處黃酒OD值；F-570 nm處米酒OD值圖1 稀釋前后黃酒和米酒OD值的變化Fig.1 Changes in OD values of Huangjiu and Mijiu before and after dilution

表1 總酸對氨基酸態氮測定結果的影響Table 1 Effect of total acid content on the determination of amino acid nitrogen

注：a為對照值，b、c分別為不同酸度下樣品3次測定值的平均值及其與對照值的相對偏差。

2.1.3 酒精含量對茚三酮比色法測定的影響

相對于啤酒，黃酒和米酒的酒精度要高出很多，黃酒中酒精度一般為8%～18%vol。隨機選取黃酒和米酒樣品各1個，調節樣品中的酒精度為0～25.35%vol，利用茚三酮比色法測定不同乙醇含量酒樣的氨基酸態氮。結果如表2所示，不同乙醇含量對2個樣品中比色法測定值的相對偏差均較小，最大為4.27%，因此可以認為黃酒或米酒的酒精含量不會對茚三酮比色法的測定結果產生明顯影響。

2.2 茚三酮比色法和甲醛滴定法精密度和準確性比較

由于黃酒或米酒的色澤、總酸及酒精含量等特性不會對茚三酮比色法的測定結果產生明顯影響，進一步對該方法測定黃酒和米酒氨基酸態氮的精密度和準確性進行檢驗，并與甲醛滴定法進行比較，結果如表3和表4所示。

表2 酒精含量對比色法測定結果的影響Table 2 Effect of alcohol content on the determination of amino acid nitrogen

注：a為對照值，b、c分別為不同酒精含量下樣品3次測定值的平均值及其與對照值的相對偏差。

對于氨基酸態氮含量相對較高的樣品(如樣品2)，2種測定方法的精密度和準確性均較好，RSD值(相對標準偏差)均小于2.00%，加標回收率也接近100%。但對于氨基酸態氮含量相對較低的樣品(如樣品1)，滴定法的精密度較差，RSD值為12.58%，且由于測定的重復性較差，因此加標回收率的變化也較大，而比色法仍表現出較好的精密度和準確性。該結果與這2種方法在鮮味提取物[17]和膠原水解物[8]中氨基酸態氮的測定結果相類似。由于滴定法所固有的誤差，當樣品氨基酸態氮含量較低(滴定值較小)時，其相對誤差較大，因而精密度和準確性相對較低。因此在測定含量相對較低的樣品(如米酒樣品)時，比色法的重復性和準確性更高。

表3 茚三酮比色法和甲醛滴定法的精密度檢驗Table 3 Precision test of ninhydrin colorimetry and formaldehyde titration

表4 茚三酮比色法和甲醛滴定法的準確性檢驗Table 4 Accuracy test of ninhydrin colorimetry and formaldehyde titration

2.3 茚三酮比色法和甲醛滴定法測定黃酒和米酒中氨基酸態氮的結果比較

在明確了茚三酮比色法測定黃酒和米酒中氨基酸態氮的可行性后，對來自不同產地、不同類型的9個黃酒樣品和8個米酒樣品分別利用茚三酮比色法和甲醛滴定法進行氨基酸態氮的測定，并與利用氨基酸分析儀測定各酒樣中17種氨基酸的定量結果進行比較分析。氨基酸分析儀測定的黃酒和米酒氨基酸含量結果如表5所示。

表5 黃酒和米酒中氨基酸分析儀測定的脯氨酸及總氨基酸含量Table 5 Content of proline and total amino acid in Huangjiu and Mijiu

首先對茚三酮比色法和甲醛滴定法的測定結果進行比較，結果如圖2-A所示，兩者對米酒和黃酒的測定結果具有很好的線性相關性(R2=0.983 1)，但滴定法的測定結果明顯高于比色法(斜率為1.371 8)。在表5中也比較了米酒和黃酒中根據氨基酸分析儀測定結果計算得到的總氨基酸態氮和α-氨基酸態氮含量，可以發現，相同樣品總氨基酸態氮含量比α-氨基酸態氮含量平均要高50%左右。一般認為，甲醛滴定法的測定結果為總的氨基酸態氮含量，而茚三酮比色法的測定結果主要為α-氨基酸態氮含量(不含α-亞氨基酸，如脯氨酸和羥脯氨酸)[13,18]，因為在570 nm處一些非α-氨基酸，如脯氨酸等與茚三酮的反應產物無明顯吸收，無法被定量[19]，因此甲醛滴定法的測定值通常會高于茚三酮比色法[8]。黃酒和米酒中含有較高含量的脯氨酸(表5)，約占總氨基酸含量的10%，進一步比較了比色法測定值加上脯氨酸態氮后與滴定法測定值的差異，結果如圖2-B，兩者的線性相關性仍然很好(R2=0.987 3)，但斜率下降至1.204 0，即兩者的差異縮小，表明脯氨酸的確是引起滴定法的測定結果高于比色法的一個重要原因。同時，由于黃酒和米酒中其他含氨基化合物，包括氨和胺類等化合物也都可能與甲醛進行反應進而被測定，使得甲醛滴定法測定氨基酸態氮的結果偏高[20]。因此，雖然茚三酮比色法和甲醛滴定法的測定結果具有較好的相關性，但由于2種測定方法存在的差異，針對不同的目的和對象，應該選擇適當的測定方法。

A-比色法與滴定法測定值的直接比較；B-比色法測定值中加入脯氨酸計算值與滴定法的比較圖2 比色法和滴定法的線性關系Fig.2 Linear relationship between ninhydrin colorimetry and formaldehyde titration

由于米酒的氨基酸態氮含量遠低于黃酒(表5)，進一步根據氨基酸分析儀測定結果，計算各酒樣中總氨基酸態氮和α-氨基酸態氮的含量，分別對黃酒和米酒茚三酮比色法和甲醛滴定法的測定結果進行比較分析，結果如圖3所示。結果表明，滴定法的測定結果更接近于總氨基酸態氮的計算含量(圖3-A、B)，其斜率相比比色法更接近于1；而比色法的測定結果則更接近于α-氨基酸態氮的計算含量(圖3-C、D)，這與之前的分析結果一致，即甲醛滴定法的測定結果為總的氨基酸態氮含量，茚三酮比色法的測定結果主要為α-氨基酸態氮含量[18]。從線性關系來看，無論是總氨基酸態氮還是α-氨基酸態氮，與比色法相比，滴定法的測定值與氨基酸分析儀的計算值線性關系相對較差(R2相對更小)，特別是對于氨基酸含量相對更低的米酒，比色法的測定值偏差較小，與氨基酸分析儀計算值的線性關系相對更好(圖3-C、D)，說明比色法與氨基酸分析儀的測定結果一致性更高。比色法雖然不能測定脯氨酸等氨基酸，但可以測定幾乎所有α-氨基酸態氮及少量其他氨態氮[21]；而氨基酸分析儀通常只能定量樣品中接近20種游離氨基酸，并非所有氨基酸。兩者測定的對象不完全相同，但絕大部分是一致的。與這2種方法相比，滴定法的測定對象則更為復雜。因此這可能是比色法與氨基酸分析儀測定結果有更好相關性的主要原因。

A-黃酒總氨基酸態氮結果比較；B-米酒總氨基酸態氮結果比較；C-黃酒α-氨基酸態氮結果比較；D-米酒α-氨基酸態氮結果比較圖3 比色法、滴定法測定結果分別與氨基酸分析儀計算結果的線性關系Fig.3 Linear relationship between colorimetric method as well as titration method and amino acid analyzer

氨基酸態氮是黃酒的產品質量指標之一，同時氨基酸也賦予了釀造酒鮮、甜、苦、咸等多種味感，使酒體具有更加豐富的味覺層次，脯氨酸也是黃酒和米酒中重要的甜味貢獻物[19]。實際上，由于氨基酸態氮各種方法測定的原理和對象不同，測定結果存在一定的差異。因此，根據不同的目的和要求，應該采用不同的測定方法。滴定法的測定結果更能反映產品總體的氨基酸水平。而在釀造過程中，酵母主要通過對游離氨基酸的利用進行生長代謝，而脯氨酸和羥脯氨酸幾乎不被酵母利用[22]，因此比色法的測定結果更能表征影響發酵過程的α-氨基氮含量。此外，如果比色法采用酶標儀進行測定，可同時對數十個微量樣品進行分析，對大量樣品的快速測定具有優勢。

3 結論

本研究主要考察了茚三酮比色法在黃酒和米酒氨基酸態氮測定中的適用性。研究結果表明，黃酒和米酒的色澤、總酸和酒精度等特性對茚三酮比色法的測定結果無顯著影響。茚三酮比色法與甲醛滴定法測定結果之間具有較好的線性關系，但甲醛滴定法測定值相對偏高。黃酒和米酒中脯氨酸及其他含氨基化合物，包括氨和胺類等化合物可能是造成兩者測定結果差異的主要原因。

雖然甲醛滴定法目前是黃酒行業通用的氨基酸態氮測定方法，但對米酒等氨基酸態氮含量較低的樣品測定時，茚三酮比色法則具有較高的精密度和準確性。對照氨基酸分析儀分析結果，甲醛滴定法更適于表征產品的總體氨基酸含量，而茚三酮比色法則能更準確反映發酵過程中的α-氨基酸含量。此外，茚三酮比色法作為一種在測定低氨基酸態氮時具有同樣高可靠性的方法，還可在較短時間內對大批量樣品進行快速測定，具有安全、低成本、易操作等優點，適合在釀造行業生產及科研中推廣。該方法不僅是對黃酒的氨基酸態氮測定方法的補充，還可為米酒行業氨基酸態氮分析指標的建立提供依據。