黑色素瘤發病過程中與腫瘤相關成纖維細胞間的相互作用

胡泰然，雷鐵池

(武漢大學人民醫院皮膚科，武漢 430060)

皮膚黑色素瘤是一種最具侵襲性和致命性的皮膚癌癥，被認為是一種由遺傳易感和環境暴露等病因引發的多因素疾病，大多數由黑色素細胞形成的痣和色素斑惡變而來，其在皮膚癌癥相關死亡率中的占比較高。晚期黑色素瘤極具侵襲性，可經血液系統和淋巴系統發生遠處轉移，同時對傳統化學療法和放射療法具有特征性抵抗，預后較差[1-3]。既往研究表明，黑色素瘤的形成不僅僅與單一的惡性細胞有關，還與腫瘤基質及腫瘤基質細胞所構成的腫瘤微環境密切相關，包括腫瘤相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)、間充質干細胞、內皮細胞和免疫細胞等[4]。其中，CAFs是腫瘤微環境中最主要的基質細胞之一，近年來，CAFs與腫瘤細胞的相互作用一直受到人們的廣泛關注。有證據表明，CAFs通過與腫瘤細胞的直接或間接接觸，在腫瘤發生、發展和轉移中發揮重要作用，使CAFs成為腫瘤治療的潛在靶點[5]。同樣，在黑色素瘤發病過程中，正常成纖維細胞(normal fibroblasts，NFs)可在黑色素瘤細胞誘導下活化形成CAFs，并與黑色素瘤細胞相互作用，促進腫瘤的生長、侵襲、致密結構形成、血管形成、轉移甚至耐藥[3]。因此，總結并闡明黑色素瘤與CAFs間的相互作用機制對黑色素瘤治療新靶點的發現具有重要意義?，F就黑色素瘤發病過程中與CAFs間的相互作用予以綜述。

1 黑色素瘤中CAFs的起源和形成

1.1NFs與CAFs的特征 正常組織中的成纖維細胞是非上皮、非免疫性細胞，表現出經典的紡錘形形態，具有可能的間充質譜系起源，通常以單細胞的形式存在于間質中，偶爾存在于毛細血管附近，與基膜無關聯。NFs通常處于靜止狀態，其代謝和轉錄組學活性極低。NFs具有分化為活化的成纖維細胞的能力，并可在隨后基于適當的刺激產生其他間充質譜系細胞[5]。

此外，CAFs還可指活化的成纖維細胞或活化的肌成纖維細胞，包括腫瘤相關的間充質干細胞，其表型與NFs完全不同，而與肌成纖維細胞非常相似[5-6]?；罨蟮某衫w維細胞可以獲得更多的分泌表型、更強的增殖特性、專門的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)重塑能力、強大的自分泌活化和動態免疫信號調節功能，進一步增加了腫瘤纖維化和腫瘤微環境的動態復雜性[4,7]。雖然CAFs和NFs均表達成纖維細胞特異性標志物，但α-平滑肌肌動蛋白、S100A4蛋白和成纖維細胞活化蛋白α等活化標志物分子僅在CAFs中表達[6]。

1.2NFs對早期黑色素瘤的抑制作用 在黑色素瘤發展的早期階段，NFs似乎與CAFs的功能相反，使用體外共培養模型時，NFs對來源于原發性黑色素瘤病變的腫瘤細胞有抑制性影響[8]。另有研究表明，當黑色素瘤第一次發生時，基質中靜息的成纖維細胞會形成屏障，并分泌一些細胞因子和化學因子，如γ干擾素、白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α，它們相互作用并抑制黑色素瘤細胞的生長[9]。此外，皮膚NFs形成的物理屏障也能阻止黑色素瘤細胞遷移并侵入周圍組織[3]。因此，NFs似乎抑制黑色素瘤在癌前病變時期的生長和進展。

1.3黑色素瘤主要以旁分泌方式促使CAFs的形成 隨著黑色素瘤的發展，黑色素瘤細胞分泌多種化學因子，誘導NFs細胞向黑色素瘤遷移、包圍，并滲入生長的黑色素瘤體[4]。這些信號還誘導基質中NFs的表觀遺傳和生化變化，從而形成CAFs。黑色素瘤中產生的血小板衍生生長因子CC刺激NFs向腫瘤的募集，并促使NFs活化為CAFs[9-10]。黑色素瘤中分泌的轉化生長因子-β能誘導NFs分化和活化成為CAFs，且Nodal蛋白作為轉化生長因子超家族成員，具有與之類似的功能[11]。

黑色素瘤細胞分泌的細胞外囊泡也可以誘導成纖維細胞重編程為CAFs。細胞外囊泡是由真核細胞釋放或脫落到腫瘤微環境中的細胞外細胞器，如外泌體和細胞微泡等。它們含有各種生物活性蛋白、信使RNA和微RNA(microRNA，miRNA/miR)，可在惡性細胞、CAFs、間充質干細胞等細胞間被相互攝取，成為細胞間通訊的關鍵[12]。黑色素瘤細胞分泌的細胞微泡可介導NFs向CAFs轉變，并調節血管細胞黏附分子-1的表達，從而增強黑色素瘤細胞與CAFs的黏附；在缺氧刺激下，黑色素瘤細胞微泡在成纖維細胞中誘導更多胞外信號調節激酶1/2磷酸化，導致血管細胞黏附分子-1表達增加，從而產生更強的黏附作用[13]。Dror等[14]報道，由黑色素瘤細胞分泌并被成纖維細胞吸收的黑素體miR-211可激活促分裂原活化的蛋白激酶信號通路，并誘導NFs重編程為CAFs。此外，黑色素瘤細胞釋放的外泌體miR-155可以促進NFs中CAFs特異性活化標志物α-平滑肌肌動蛋白和成纖維細胞活化蛋白的表達[15]。由此可見，黑色素瘤細胞主要以旁分泌形式影響NFs的表觀遺傳，并使其活化成為CAFs。

2 CAFs促進黑色素瘤的生長

各種體內外模型已證實CAFs對黑色素瘤生長的促進作用。如白細胞介素-6、白細胞介素-8、CXC趨化因子配體1、胰島素樣生長因子2、成纖維細胞生長因子7和轉化生長因子-β3等參與了CAFs與黑色素瘤細胞之間的交互作用，上述細胞因子參與免疫反應，并誘導炎癥發生、刺激黑色素瘤生長[3,10]。使用腫瘤異種移植模型對黑色素瘤進行研究發現，與NFs相比，CAFs能顯著促進與其共注射的黑色素瘤細胞的生長，并可過度表達成纖維細胞活化蛋白，導致免疫抑制性腫瘤環境的產生[16]。因此，調節CAFs促進黑色素瘤生長的分子機制受到人們的關注。

在原位皮膚癌模型中，皮膚成纖維細胞中雄激素受體表達的下調能誘導CAFs活化的早期步驟，并增強黑色素瘤細胞的致瘤性。雄激素受體能抑制CAFs效應基因的轉錄過程，進而抑制腫瘤生長[17]。在軟瓊脂集落形成試驗中，CAFs通過產生可溶性因子支持黑色素瘤細胞的生長；當阻斷CAFs中的β聯蛋白信號時，B-Raf激酶活化的同源性磷酸酶及張力蛋白可顯著抑制缺陷小鼠體內黑色素瘤的生長。由β聯蛋白消融導致的死亡CAFs可以釋放促凋亡或生長抑制因子，從而誘導黑色素瘤細胞的細胞周期停滯和凋亡[16]。因此，皮膚成纖維細胞中的雄激素受體和β聯蛋白在調控CAFs促進黑色素瘤生長的信號通路中均發揮重要作用。

3 CAFs有助于黑色素瘤致密結構的形成和耐藥

黑色素瘤細胞主動募集成纖維細胞并刺激其分泌ECM，進而促進ECM的運動。在結構上，與僅存在黑色素瘤細胞的瘤體相比，黑色素瘤細胞與CAFs形成的共培養瘤體更小、更緊湊、更有條理。CAFs促成黑色素瘤致密結構形成的大致過程為：病程早期，發病部位只存在少量的游離黑色素瘤細胞和成纖維細胞。隨后，黑色素瘤細胞刺激成纖維細胞，使其獲得功能過度活化的特征，形成CAFs。除增殖性和運動性增強外，CAFs還釋放了更多的生長因子和蛋白酶(如基質金屬蛋白酶)，并增加ECM蛋白(如纖維粘連蛋白、肌腱蛋白、層粘連蛋白和膠原蛋白Ⅳ等)的表達，從而獲得強大的ECM生物合成和沉積能力。隨后，游離的黑色素瘤細胞遷移到ECM中穩定下來，形成固定的黑色素瘤細胞，并分裂產生新的游離黑色素瘤細胞。在分裂的過程中，固定癌細胞會在空間上進行自我封閉，最終形成封閉的隔室[3-5,10]。因此，實體瘤致密、纖維化的本質被認為是成纖維細胞浸潤和ECM蛋白沉積的直接結果，這一結果可以防止治療性藥物到達黑色素瘤組織核心的黑色素瘤細胞處，從而促成腫瘤的耐藥性。

4 CAFs協助黑色素瘤進行上皮-間充質轉化的過程

在黑色素瘤中，上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)表現為從上皮細胞轉變為具有功能性間充質表型的惡性黑素細胞，這一過程被認為具有驅動黑色素瘤細胞獲得轉移潛能和侵襲性質的作用。EMT的重要標志包括上皮鈣黏素表達的下調和神經鈣黏素表達的增加。正常黑素細胞存在于靠近基膜的表皮中，形成表皮黑色素單元，其中含有一個黑素細胞和多達36個角質形成細胞。正常生理情況下，由于上皮鈣黏素的表達，黑素細胞黏附于角質形成細胞，導致黑素細胞生長、樹突形成和黑色素瘤相關細胞表面分子的表達受限。隨著黑素細胞的突變，惡性黑色素瘤細胞的增殖速度加快，且上皮鈣黏素的表達向神經鈣黏素轉換。不同類型黏附分子間的表達轉換導致黑色素瘤細胞與鄰近角質形成細胞之間失去接觸，并與表達神經鈣黏素的CAFs相結合，促使黑色素瘤細胞遠離角質形成細胞并侵入下方真皮，通過血液系統和淋巴系統遷移至遠處組織，并建立轉移[3,5,18]。

除上皮鈣黏素和神經鈣黏素外，其他的EMT標志物(Snail1、Snail2、鋅指E盒結合蛋白1、鋅指E盒結合蛋白2、Twist和Claudin-1等)也在黑色素瘤的EMT過程中發揮了重要作用。通過上調上皮標志物(上皮鈣黏素)和下調間充質標志物(鋅指E盒結合蛋白1和鋅指E盒結合蛋白2)顯示，CAFs失活后，黑色素瘤細胞中的EMT過程受阻[16]。細胞極性的喪失是EMT過程的關鍵，而緊密連接蛋白Claudin-1積極參與維持上皮細胞的頂端-基底極性，因此，CAFs失活后Claudin-1表達增加進一步證明CAFs促進了EMT過程。此外，阻斷CAFs中β聯蛋白的信號轉導后，黑色素瘤細胞中鋅指E盒結合蛋白1和Snail的表達下調，且與Claudin-1表達增加相關[16,19]?？梢?，β聯蛋白不僅在CAFs促進黑色素瘤生長中十分關鍵，而且在EMT過程中也發揮重要作用。

5 CAFs與黑色素瘤通過相互作用促進腫瘤血管生成

黑色素瘤是高度血管化的腫瘤，因為CAFs可通過分泌一些促血管生成因子作用于黑色素瘤，以促進腫瘤血管生成，如血管內皮生長因子A、成纖維細胞生長因子2以及基質金屬蛋白酶等蛋白水解酶[15,20]。血管內皮生長因子A和成纖維細胞生長因子2可與血管內皮細胞結合并激活各種信號轉導途徑下游，從而促進血管內皮細胞的增殖、擴散和遷移[15]。CAFs分泌的基質金屬蛋白酶13可通過釋放ECM中的血管內皮生長因子促進腫瘤血管生成，從而增加鱗狀細胞癌或黑色素瘤的侵襲[21]；而CAFs分泌的基質金屬蛋白酶9是一種促血管生成的ECM重構酶，能幫助重建ECM，以促進血管內皮細胞穿過ECM構成的結構屏障[15]。

另一方面，黑色素瘤也通過旁分泌方式加強CAFs的促腫瘤血管生成作用。如結締組織生長因子可由CAFs表達，并在黑色素瘤中過表達，能誘導基質和腫瘤中CAFs的活化，并進一步導致內皮標志物CD31/血小板內皮細胞黏附分子的表達水平升高，最終增加腫瘤血管的體積[22]。此外，黑色素瘤細胞分泌的外泌體miR-155可以直接傳遞到成纖維細胞中，誘導CAFs的形成并抑制細胞因子信號轉導抑制分子1的表達[15]。細胞因子信號轉導抑制分子1表達的抑制會導致Janus激酶2/信號轉導及轉錄激活因子3信號通路的激活以及血管內皮生長因子、成纖維細胞生長因子2和基質金屬蛋白酶9的過度表達，觸發CAFs的促血管生成作用[15,23]。

6 CAFs誘導黑色素瘤轉移并參與轉移前龕的形成

活化的CAFs在黑色素瘤的轉移過程中不可或缺，是轉移病變形成和發展的關鍵因素。CAFs分泌的分泌型卷曲相關蛋白2能激活黑色素瘤細胞中的多步信號級聯，導致β聯蛋白和小眼相關轉錄因子的減少，最終使腫瘤的血管生成和轉移增加[24]。同時，CAFs還可以通過影響原發腫瘤ECM的硬度增強黑色素瘤細胞的侵襲，并可能產生ECM軌跡，以指導黑色素瘤細胞的侵襲[25-27]。

另外，在黑色素瘤遠處轉移過程中，CAFs參與了轉移前龕的形成，并介導了轉移部位繼發性腫瘤的生長。轉移前龕是可能發生腫瘤繼發性轉移的部位所形成的微環境，主要由CAFs、浸潤性免疫細胞、內皮細胞等組成。轉移前龕必須創造一個支持性微環境，以便經循環系統到達此處的惡性腫瘤細胞駐留、生長和建立第二個腫瘤[28-30]。在黑色素瘤中，CAFs參與了轉移前龕的形成，并通過與腫瘤微環境和轉移前龕中不同類型細胞的相互作用介導各種促進腫瘤轉移的過程[31]。首先，黑色素瘤原發部位的CAFs可通過釋放生長因子和細胞因子來增強轉移，直接或間接刺激遠處轉移位點中黑色素瘤細胞的生長和侵襲[5,32]。對自發性黑色素瘤轉移模型的研究顯示，成纖維細胞在黑色素瘤肺轉移微環境中被激活為CAFs：由轉移性黑色素瘤細胞分泌的外泌體在肺成纖維細胞中激發肺成纖維細胞的活化，進而引發CAFs促炎基因的表達，發揮促炎功能[31]。轉移到肝臟的黑色素瘤則依賴于肝星狀細胞(肝臟駐留成纖維細胞)激活形成CAFs來支持腫瘤血管的生成[33]。

7 小 結

黑色素瘤細胞通過分泌各種化學因子、細胞外囊泡等誘導正常成纖維細胞活化成為CAFs；同時，CAFs也反過來直接或間接地影響黑色素瘤的進展，兩者之間的相互作用機制可以為黑色素瘤治療提供新思路：CAFs表達的結締組織生長因子對于B-Raf激酶抑制性抵抗的黑色素瘤可能是一個新的治療靶點；引發CAFs促血管生成啟動的外泌體，miR-155可成為黑色素瘤抗血管生成療法的潛在靶標；以黑色素瘤細胞和CAFs為共同目標的組合治療有希望成為克服治療抗性的新策略。在黑色素瘤細胞分泌的細胞外囊泡中，除miRNA外，其他組分對促進CAFs形成的作用，以及CAFs在黑色素瘤免疫逃逸中發揮的作用，仍需要進一步研究的證實。