腫瘤相關基因甲基化檢測試劑臨床前研究要點

包雯

國家藥品監督管理局 醫療器械技術審評中心，北京 100081

我國體外診斷產業正處于蓬勃發展的階段，新的產品層出不窮，尤其是用于惡性疾病輔助診斷的試劑，其主要類別之一為腫瘤相關基因甲基化檢測試劑。已上市的產品積累了一定的技術基礎，但尚存在性能驗證不充分的問題。如何在符合我國國情的前提下，指導企業科學合理地開展腫瘤相關基因甲基化檢測試劑的性能評價，從而加速相關產品的注冊申報，成為亟待解決的問題。這就要求企業不僅應重視臨床試驗的開展，也須系統而全面地進行臨床前性能的研究，以綜合評價產品的安全有效性。

臨床前研究指的是從產品原材料的選擇、反應體系的確認、企業參考品的設置、生產工藝的研究到產品分析性能評估，以及陽性判斷值的確定的階段。本文結合作者的工作經驗，闡述了腫瘤相關基因甲基化檢測試劑的技術審評關注點。旨在通過梳理企業在產品研發過程中面臨的共性問題，指導相關產品的注冊申報，其他一般性要求可參照相關的規范性文件。需要注意的是，企業應使用在有效運行的生產質量管理體系下生產的多批產品進行分析性能評估，以及確定陽性判斷值。

此外，有效評價體外診斷試劑的分析性能，正確確定陽性判斷值，將會大幅提高臨床評價指標滿足驗收標準的概率，反之可能對臨床試驗結果（如靈敏度和特異性）造成不利影響。

1 腫瘤相關基因甲基化檢測試劑的背景

人類基因組DNA的甲基化目前發現存在于“CG”二核苷酸中的胞嘧啶堿基（C）上，是人類的表觀遺傳修飾方式之一，能夠調節基因的表達?；騿幼訁^CpG島的甲基化通常被認為是基因表達降低甚至沉默的標志。正常人群中的抑癌基因啟動子區CpG島一般為低甲基化狀態，當其發生異常高甲基化時，將會使細胞逃逸凋亡、DNA修復缺陷、血管生成或發生黏附功能缺失等。于是，特定基因DNA甲基化水平和模式的改變與腫瘤的發生密切相關[1]。例如，相對于正常結直腸組織，SDC2基因在不同分期的結直腸癌和部分進展期腺瘤組織中呈高水平甲基化狀態，提示對其進行檢測具有輔助診斷結直腸癌和進展性腺瘤的臨床應用價值[2-3]。另外，美國FDA已批準KRAS基因突變、BMP3/NDRG4基因甲基化和便隱血聯合檢測試劑，用于50歲及以上典型平均風險的結直腸癌患者篩查，但不能替代高風險人群的結直腸鏡檢查。

甲基化試劑的研發分為臨床前研究和臨床試驗兩個階段。我國已有Septin9和SDC2基因甲基化檢測試劑盒等數個產品上市，用于結直腸癌的輔助診斷。目前有多個產品正在注冊申報過程中，通過聯合檢測多個基因的甲基化狀態，用于結直腸癌、肝癌、宮頸癌等的輔助診斷。該類產品一般基于實時熒光定量PCR技術，檢測糞便、血液或組織樣本中腫瘤相關基因的甲基化狀態。預期用途為結合影像學、病理學等其他檢測手段，用于對有相關適應癥疑似癥狀患者的輔助診斷。其檢測結果僅供臨床醫生參考，不作為腫瘤早期診斷或確診的依據，臨床醫生應結合患者病情及其他檢測指標進行綜合判斷。

2 腫瘤相關基因甲基化檢測試劑企業參考品的設置

此類產品目前尚無適用的國家參考品，企業應在保證產品原材料和生產工藝穩定可靠的基礎上，科學合理地設置企業參考品，并相應地進行產品性能驗證以及后續的產品檢驗。

陽性參考品考慮檢出能力的驗證，建議設置為不同濃度水平的相關適應癥患者樣本或標準細胞系。陰性參考品則考慮檢測特異性的評價，可為其他相關腫瘤類型的患者樣本、其他基因甲基化的樣本或標準細胞系等。精密度參考品包含中等強度陽性、弱陽性和陰性水平樣本。檢出限參考品包含不同背景核酸濃度下、目標基因不同甲基化比例的樣本；可采用臨床樣本或細胞系，基質建議使用臨床陰性樣本。注意，不建議采用亞硫酸鹽轉化的DNA（bisDNA）作為企業參考品的原料。

3 腫瘤相關基因甲基化檢測試劑反應體系的研究

3.1 樣本要求

對樣本采集與處理的過程進行充分研究，包括樣本采集方法、原始樣本用量和核酸用量等。建議納入數十例臨床樣本，充分評價樣本采集、核酸提取和轉化過程的精密度。

3.2 核酸提取、轉化和純化環節的性能

首先評價核酸提取試劑的提取效率、濃度和純度。另外對甲基化轉化過程進行研究，即轉化能力的評價，包括核酸回收率、轉化效率和保護效率。建議與焦磷酸測序或其他商業化轉化試劑盒進行比較。

注意，須采用臨床真實樣本充分評價轉化前后DNA的含量、內參基因的量值、各個基因的甲基化狀態以及比例等。

4 腫瘤相關基因甲基化檢測試劑的分析性能評估[4]

體外診斷試劑的通用要求是由相關企業在主要原材料和反應體系經過確認、生產工藝得到有效控制并且保證產品質量穩定的基礎上，制訂方案并相應地開展研究。試驗人員應經過必要的培訓，熟悉檢測系統的操作程序、樣本制備方式和試驗方案，嚴格執行校準和質量控制方法。在對結果進行數據檢查后，選擇適當的統計方法進行分析，并形成研究報告。

以下闡述了腫瘤相關基因甲基化檢測試劑的具體評價內容，包括推薦的研究方法以及采用的樣本類型。

4.1 測量準確度（accuracy of measurement）[5-7]

測量準確度包括正確度和精密度，受系統誤差和隨機誤差共同影響。建議綜合考慮不精密度和偏倚的影響，首選采用總分析誤差較小的對比方法進行比較研究。

4.1.1 正確度（trueness） 首選采用與臨床診斷結果進行比較研究的方式，評價試劑的診斷靈敏度?；虿捎门c已上市同類產品進行方法學比較研究的方式，通過計算陰陽性符合率和總符合率，評價試劑與同類產品的一致性。如無同類產品，也可采用核酸序列測定方法，如高通量測序或數字PCR法等。

建議使用臨床真實樣本，納入不同分期的相關腫瘤適應癥樣本進行符合性研究，另外納入其他易轉移至原發腫瘤部位的癌癥類型、腫瘤部位的其他良性疾病、其他相關腫瘤類型的患者樣本對試劑進行特異性評價。

樣本可為有明確診斷結果的患者樣本或者參考樣本盤等。

4.1.2 精密度（precision） 即重復性、中間精密度和重現性，主要變量包括操作者、儀器、運行、試劑批次、校準品批次、校準周期、時間、地點等。

建議使用臨床樣本進行評價，包括陰性、弱陽性以及中等陽性水平的樣本。

4.2 分析靈敏度（analytical sensitivity）[8]

對于定性檢測試劑而言即為最低檢測限。選取特定濃度的陽性樣本梯度稀釋進行最低檢測限的確定。建議設置多個濃度梯度，每個濃度重復檢測不少于3次，以100%可檢出的最低濃度水平作為預設檢測限。在此濃度附近制備若干濃度梯度樣品，每個濃度至少重復檢測20次，將具有95%陽性檢出率的最低濃度作為最低檢測限。建議使用臨床陰性樣本作為基質，充分評價在不同DNA濃度下，試劑對于不同甲基化比例目標基因的檢出能力。

樣本可為標準細胞系或特定濃度的臨床陽性樣本。注意應對其甲基化狀態進行確認，可采用進行甲基化轉化后測序，驗證甲基化序列位點的方法。

4.3 分析特異性（analytic specificity）

4.3.1 交叉反應（cross reactivity） 包括具有同源性序列的核酸片段、其他基因甲基化樣本等。

4.3.2 干擾物質（interference）[9]包括血紅蛋白、脂質、膽紅素、自身免疫抗體、常用藥物及其代謝物、患者使用的治療藥物、抗凝劑和已有報道的干擾物質等。

建議對樣本中可能存在的內源性及外源性干擾物質進行研究。具體方法為使用多份弱陽性、陽性的臨床樣本，分別添加醫學決定水平濃度的干擾物質（建議為可能存在的最高濃度水平），每個樣本重復檢測不少于3次，評價待測物的回收率，確定是否產生干擾。

5 腫瘤相關基因甲基化檢測試劑陽性判斷值的確定[10-11]

陽性判斷值在鑒別良性與惡性疾病、確定疾病進程等方面具有重要意義。正確制定陽性判斷值能夠充分體現試劑的臨床性能，如診斷準確性等。下述內容包括推薦的研究方案以及采用的樣本類型。

對于包含多個腫瘤相關基因甲基化的檢測試劑，可分別確定不同單個目標基因和內參基因Ct值的差值或拷貝數的比值，判定檢測結果的陰陽性。在此基礎上，采用邏輯回歸模型分析，初步建立公式，具體為賦予各個自變量（ΔCt值）不同的回歸系數并計算總體分值，以達到與診斷結果一致性最佳的目的。再根據上述分值進行ROC曲線分析，選擇約登指數最大值點或者平衡臨床性能最優的靈敏度和特異性界值，從而確定試劑的陽性判斷值。其量值單位可為ΔCt值或者分值。

陽性判斷值的確定過程包括建立與確認兩個階段。建議區分訓練集和驗證集，分別納入不同的樣本子集，以保證算法模型的可靠性。注意采用臨床真實樣本進行研究，應來源于試劑預期的適用人群以及相關適應癥并充分覆蓋不同的亞組。樣本總數量可為數百例。

另外，考慮到確定陽性判斷值時使用的樣本對于目標人群的代表性有限，建議通過臨床試驗進一步確認陽性判斷值的準確性。

6 結語

隨著腫瘤相關基因甲基化檢測試劑的涌現，針對產品設計開發過程中存在的技術難點以及合規性問題，必要的解決手段之一是指導企業如何規范地開展臨床前研究，不但能夠提高臨床試驗成功的可能性，并且有助于后續產品注冊的順利進行。

本文結合國際通用注冊申報規范性文件、相關技術指南等，對腫瘤相關基因甲基化檢測試劑反應體系研究、分析性能評估以及陽性判斷值確定的關鍵要素進行了初步探討，期望有助于相關企業更具針對性地進行相關試劑的臨床前研究，相應地大幅提高產品的注冊申報效率。此外，期待與各方協作探索更加優化的評價方法，共同努力提升研究質量。