吸血動物和蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制劑功能研究進展

朱明儒，吳若男，肖蓉

遼寧師范大學 生命科學學院，遼寧 大連 116081

半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cystatin）是一類普遍存在于病毒、細菌、原生動物、植物和哺乳動物體內的蛋白酶抑制因子，能夠與半胱氨酸蛋白酶可逆地競爭性結合并抑制其活性，從而參與調節機體多種生理和病理過程，如蛋白質分解代謝、感染與免疫、腫瘤的侵襲和轉移等[1-2]。早在1968年，Fossum和Whitaker兩位學者從雞蛋清中分離得到一種能夠抑制無花果蛋白酶、木瓜蛋白酶及二肽酶活性的半胱氨酸蛋白酶抑制劑[3]；隨后，Anastasi等首次采用親和層析法分離得到該蛋白酶抑制劑的純品，將其命名為cystatin[4]。此后，陸續有學者相繼從不同物種中分離得到多種cys-tatin成員，從而構成一個龐大的cystatin超家族。

根據序列相似性、對蛋白酶活性抑制強弱以及是否存在二硫鍵，cystatin超家族成員可分為3類，即Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型[5]。Ⅰ型又稱stefin（胱抑蛋白）家族，主要為細胞內蛋白質。每個成員約由98個氨基酸殘基組成，相對分子質量（Mr）約11 000，無二硫鍵和糖基化側鏈，分布于上皮細胞和多形核白細胞內，代表成員如人類stefin A和B。Ⅱ型又稱cystatins家族，是cystatin超家族的主要代表，為分泌性蛋白質。每個成員約由120個氨基酸殘基組成，Mr約為14 000，含有2個鏈內二硫鍵，并且含有1個在胞外定位的信號肽，主要存在于體液中。該家族成員能抑制木瓜蛋白酶樣超家族的半胱氨酸蛋白酶，如木瓜蛋白酶、組織蛋白酶B、H和L[6]。另外，有些Ⅱ型cystatins成員，如cystatin C、E/M和F還能抑制哺乳動物的天冬酰胺內肽酶（asparaginyl endopeptidase，AEP）活性，并在機體免疫過程中阻礙AEP參與抗原的加工與呈遞[7]。Ⅲ型又稱為kininogens（激肽原）家族，為分泌性單鏈蛋白質，主要存在于血漿及分泌液中。kininogens家族成員由多個Ⅱ型cystatin樣結構域組成，含有多個二硫鍵及糖基，Mr為60 000～120 000[8]。cystatin超家族成員在空間結構上高度相似，都含有保守的疏水結構域，即靠近N端的甘氨酸（Gly）、第一個發夾環Q-X-V-X-G區域（有些成員為Q-X-X-X-G序列），以及第二個發夾環脯氨酸和色氨酸（P-W）。cystatin超家族成員通過這3個基序以非共價鍵結合蛋白酶，從而阻斷蛋白酶活性位點與其作用底物的結合。由于cystatin并不直接嵌入酶的活性中心，因此最終形成可逆的、緊密結合的酶-抑制劑復合物[9-10]。

1 吸血動物cystatin超家族成員功能研究進展

1.1 蜱蟲cystatin超家族成員功能研究進展

已有研究顯示cystatin在蜱蟲的生長發育、吸血、血紅蛋白消化以及對宿主免疫系統的調節過程中起著非常重要的作用。目前，研究發現蜱蟲主要含有2種類型的cystatin超家族成員，分別屬于Ⅰ型和Ⅱ型。近年來，已經有大量研究對來自不同硬蜱和軟蜱的多種cystatin分子進行了鑒定分析，并探究了其在蜱蟲生理中的作用。

蜱蟲Ⅰ型stefin家族成員缺乏信號肽，為細胞內蛋白質，參與調節蜱蟲的生長發育及細胞內血紅蛋白的消化過程。2006年，Lima等從微小牛蜱（Boophilus microplus）的脂肪體cDNA文庫中鑒定出一種Ⅰ型stefin家族成員，命名為Bmcystatin。半定量PCR和Western印跡分析表明Bmcystatin不僅存在于微小牛蜱的脂肪體中，還存在于其唾液腺及卵巢中[11]。序列分析表明Bmcystatin與來自肩突硬蜱（Ixodes scapularis）唾液的Ⅰ型stefin家族成員具有70%的序列一致性。除了能夠抑制組織蛋白酶L，Bmcystatin還對微小牛蜱中半胱氨酸內肽酶的活性具有抑制作用。由于該半胱氨酸內肽酶可降解卵黃素，因此作者推測Bmcystatin在蜱蟲胚胎發育過程中具有重要作用[11-12]。

2009年，Zhou等從長角血蜱（Haemaphysalis longicornis）腸上皮細胞中鑒定出一種Ⅰ型stefin家族成員，并經原核表達得到重組蛋白Hlcyst-1（cystatin from tickH.longicornis）。序列分析表明Hlcyst-1與Bmcystatin具有79%的序列一致性。Hlcyst-1對組織蛋白酶B和H表現出較小的抑制活性[13-14]。但是，Yamaji等發現Hlcyst-1在長角血蜱中可以抑制一類組織蛋白酶L樣的半胱氨酸蛋白酶（H.longicorniscathepsin L-like，HlCPL-A）。由于HlCPL-A能夠降解牛血紅蛋白，因此Hlcyst-1可有效抑制HlCPL-A的血紅蛋白分解活性。在長角血蜱的吸血過程中，Hlcyst-1和HlCPL-A的轉錄水平不斷上調，并在48 h達到最高水平。因此，Yamaji等推測Hlcyst-1可以協同HlCPL-A調控蜱蟲血液消化的過程[15-16]。

近年來，對蜱蟲Ⅱ型cystatins家族成員的研究較多。通常，Ⅱ型cystatins家族成員在蜱蟲的中腸和唾液腺組織中分泌表達。2010年，Yamaji和Zhou等陸續從長角血蜱的中腸和唾液腺組織中鑒定出3種Ⅱ型cystatins家族成員，即Hlcyst-2、Hlcyst-3和HlSC-1[15-17]。其中Hlcyst-2、Hlcyst-3主要源自長角血蜱的中腸組織，而HlSC-1則是在長角血蜱的唾液腺中被鑒定出來。酶活測定結果表明Hlcyst-2、Hlcyst-3和HlSC-1都對木瓜蛋白酶和組織蛋白酶L具有抑制活性，且Hlcyst-2還可抑制組織蛋白酶H的活性。長角血蜱經血液喂養后，Hlcyst-2轉錄產物不僅主要存在于長角血蜱所有發育階段的中腸組織中，還存在于其血細胞和唾液腺中，且表達水平隨著長角血蜱的發育階段而不斷增加[15]。與Hlcyst-1一樣，Hlcyst-2可以通過抑制HlCPL-A的活性來阻止其對血紅蛋白的降解，這表明Hlcyst-2也可參與調控長角血蜱的血液消化及發育過程[15]。此外，將細菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）注射到成年長角血蜱后，Hlcyst-2轉錄產物上調。這意味著Hlcyst-2還可能參與調節蜱蟲的天然免疫過程[13]。

迄今，在蜱蟲中發現較早且研究最多的Ⅱ型cystatins成員是來自肩突硬蜱唾液腺的sialostatin L和L2。這2種蛋白具有75%的序列相似性，且二者都可抑制組織蛋白酶L和S的活力[18]。在角叉菜膠誘導的小鼠爪水腫模型中，sialostatin L可通過抑制小鼠細胞毒性T淋巴細胞系CTLL-2的增殖進而降低小鼠爪水腫的程度。這表明sialostatin L具有抗炎活性[19]。另外，sialostatin L還可強烈抑制Th9淋巴細胞產生白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）和IL-9。通常，宿主在遭受到寄生蟲感染時，可產生IL-9，同時，產生的IL-9可通過進一步促進肥大細胞生長來促使宿主產生免疫應答反應以保護宿主免受寄生蟲的入侵。如果IL-9在宿主體內的產生減少，寄生蟲在宿主體內就更易存活。這就意味著在肩突硬蜱的寄生過程中，sialostatin L可通過抑制IL-9的產生來有效阻止宿主的免疫反應以保證其在宿主體內的存活[20]。因此，在不久的將來，sialostatin L的這一特性可用來開發治療過敏性和自身免疫疾病的新藥。此外，還有研究報道IL-9主要參與誘導哮喘的形成。在小鼠實驗性哮喘模型中，sialostatin L還可通過抑制IL-9的產生進而幾乎完全消除了小鼠的氣道高反應性（airway hyper reactivity，AHR）以及嗜酸性粒細胞增多的癥狀[21]。這表明sialostatin L還具有治療哮喘疾病的作用，這也為今后研發治療哮喘疾病的新策略及新藥篩選提供了線索。

盡管有效抑制宿主的免疫反應對蜱蟲的攝食成功至關重要，但是，在抑制宿主免疫反應的同時，蜱蟲還可在宿主體內大肆傳播病原體。Ⅰ型干擾素（interferon，IFN）主要由樹突狀細胞（dendritic cells，DC）產生，在宿主防御蜱蟲傳播病原體的過程中至關重要。目前研究發現sialostatin L2可通過抑制信號傳導及轉錄激活因子1/2（signaltransducersand activatorsoftranscription-1/2，STAT-1/2）的磷酸化進而干擾IFN觸發的信號轉導。這樣，伯氏包柔螺旋體（Borrelia burgdorferi）便在sialostatin L2的保護下在宿主體內傳播，最終可引起萊姆病。因此，sialostatin L2不僅是蜱蟲攝食成功的關鍵因素，同時也是病原體在宿主體內傳播的關鍵靶點[22]。同時，還有報道稱sialostatin L2可通過抑制巨噬細胞還原型輔酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）來促進其細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生，從而抑制caspase-1的激活及其介導的炎癥反應，最終在阻斷宿主免疫應答方面發揮重要作用[23]。

2006年，Grunclová等從來自非洲鈍緣蜱（Ornithodoros moubata）的cDNA文庫中分離鑒定出2種Ⅱ型cystatins成員，分別是Om-cystatin 1和Om-cystatin 2。經原核表達后，重組蛋白Om-cystatin 1和Om-cystatin 2均可有效抑制木瓜蛋白酶及組織蛋白酶B、C、H的活性[24]。LPS刺激DC后，重組蛋白Om-cystatin 1和Om-cystatin 2均可抑制DC分泌促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）和 IL-12，并減少由 DC誘導的抗原特異性CD4+T細胞的增殖，從而參與機體的免疫應答反應[25]。與sialostatin L相似，Om-cystatin 2還能夠強烈抑制組織蛋白酶L和S的活性。不過，Om-cystatin 2對組織蛋白酶B、C、H的抑制效率比sialostatin L更高[26]。此外，Omcystatin 2和sialostatin L還可與組織蛋白酶S發生相互作用，即通過抑制組織蛋白酶S的活性進而抑制DC的成熟，阻斷宿主的免疫反應，從而使蜱蟲能夠輕松寄生在宿主體內，吸食血液。此外也有研究報道，降低Om-cystatin 2和sialostatin L2的表達會顯著抑制蜱蟲的攝食能力[27]。這表明Om-cystatin 2可協同sialostatin L2參與調控蜱蟲的進食過程。

2015年，Wei等先后從鐮形扇頭蜱（Rhipicephalus haemaphysaloides）的cDNA文庫中鑒定出2種cystatin成員，分別是Ⅰ型stefin成員RHcyst-1和Ⅱ型cystatins成員RHcyst-2。在蜱蟲的不同發育階段，實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）結果顯示RHcyst-1在卵中的表達量最高，且RHcyst-1經基因沉默后會顯著降低蜱蟲的產卵率。這表明RHcyst-1可能參與調控蜱蟲的早期胚胎發育過程。此外，與未吸血的蜱蟲相比，RHcyst-2在吸血蜱蟲所有組織中的表達均明顯上調。這表明RHcyst-2參與調節蜱蟲的吸血過程。原核表達的RHcyst-1和RHcyst-2重組蛋白都對組織蛋白酶L、B、C、H、S以及木瓜蛋白酶等半胱氨酸蛋白酶的活性具有明顯的抑制作用[28-29]。由于目前研究證實組織蛋白酶L、S在腫瘤細胞的侵襲和遷移中發揮關鍵作用[30-31]，是控制腫瘤細胞轉移的有效靶點，因此，組織蛋白酶L和S的抑制劑，如RHcyst-1，應具有潛在的抗腫瘤轉移活性。隨后，Wei等發現RHcyst-1可有效抑制人宮頸癌HeLa、肺癌A549、卵巢癌SKOV-3和小鼠黑色素瘤B16F10等4種不同腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。在體內動物實驗中，將小鼠黑色素瘤B16F10細胞移植入C57BL/6小鼠體內，同時將RHcyst-1直接注射至黑色素瘤內部后，荷瘤小鼠腫瘤的生長被顯著抑制。同時，RHcyst-1不僅對小鼠體內其他組織器官無毒性，還可提高荷瘤小鼠的存活率[32]。因此，RHcyst-1將有可能成為治療人宮頸癌、肺癌、卵巢癌和小鼠黑色素瘤等腫瘤疾病的重要候選藥物。

2017年Rangel等從全溝硬蜱（Ixodes persulcatus）中分離出3種新型cystatin家族成員，分別命名為JpIpcys2a、JpIpcys2b和JpIpcys2c。序列分析表明JpIpcys2b基序保守，具有Ⅱ型cystatins家族成員的典型特征，而在JpIpcys2a和JpIpcys2c序列中則存在不同于Ⅱ型家族成員典型特征的突變。蛋白質-蛋白質對接模擬實驗進一步揭示了JpIpcys2a、JpIpcys2b和JpIpcys2c與人組織蛋白酶L的結合位點保守，并且，該結合位點均覆蓋了活性位點裂口，可以有效阻止底物進入蛋白酶催化區域。其中，JpIpcys2a與人組織蛋白酶L結合可形成較為穩定的復合物，而JpIpcys2b和JpIpcys2c與人組織蛋白酶L結合形成的復合物穩定性則較低。同時，活性檢測結果表明JpIpcys2a對組織蛋白酶B、C、L均具有抑制作用，其中對組織蛋白酶B和L的抑制效果較為明顯。此外，RT-PCR結果表明JpIpcys2a、JpIpcys2b和JpIpcys2c轉錄本存在于全溝硬蜱的不同組織和幼蟲發育時期中，這表明JpIpcys2a、JpIpcys2b和JpIpcys2c廣泛參與全溝硬蜱的發育過程[33]。系統發育樹表明JpIpcys2a與肩突硬蜱的sialostatins L和L2親緣關系較近。這表明JpIpcys2a可能同樣具有抗炎活性以及抑制細胞毒性T淋巴細胞增殖的功能。Parizi發現抗重組 BrBmcystatin2b（rBrBmcys2b）、重組 BrBmcystatin2c（rBrBmcys2c）或重組 JpIpcys2a（rJpIpcys2a）的血清能夠識別微小牛蜱的唾液、唾液腺、卵巢、腸道、脂肪體以及幼蟲中的天然cystatin，但程度不同。其中，抗rBrBmcys2c血清能識別部分充血雌性微小牛蜱腸道、卵巢、唾液腺和脂肪體組織中的cystatin，抗JpIpcys2a血清可以識別部分充血和完全充血的雌性微小牛蜱唾液腺中的cystatin以及rBrBmcys2b，而抗rBrBmcys2b可以識別以上所有組織中的天然cystatin[34-35]。上述結果證明這些重組cystatin與天然cystatin之間存在交叉抗原性。借此，JpIpcys2a、BrBmcys2b和BrBmcys2c可作為抗蜱疫苗的抗原，具有潛在應用前景。

綜上所述，蜱蟲cystatin家族成員不僅具有cystatin超家族典型的生物學功能，既可抑制半胱氨酸類蛋白酶的活性，還在蜱蟲的生長發育、寄生吸血、血液消化、應對宿主免疫調節以及抗腫瘤等方面發揮重要作用。因此，對蜱蟲cystatin家族成員作用機制的深入研究，不僅可為今后有效防治寄生蟲奠定理論基礎，還可為開發新型的抗炎以及抗腫瘤藥物提供線索。

1.2 水蛭cystatin超家族成員功能研究進展

水蛭又名螞蟥，主要以吸食動物血液為生。不過遺憾的是，迄今關于環節動物先天性免疫調控作用機制的研究還相對較少。2004年，Lefebvre等首次采用大腸桿菌和藤黃微球菌（Micrococcus luteus）混合菌刺激整嵌晶蛭（Theromyzon tessulatum），并對其進行轉錄組學研究，以鑒定挖掘免疫應答反應的相關功能基因。在鑒定出來的64種功能基因中，Lefebvre等克隆并表達了與哺乳動物stefin B具有較高同源性的半胱氨酸蛋白酶抑制劑B，并將其命名為Tt-cysb。分析表明Tt-cysb與人類stefin B具有54%的序列一致性。原位雜交和免疫細胞化學結果表明Tt-cysb僅在水蛭的大型體腔細胞中表達，且其表達量在經混合細菌處理后的24 h內持續上調[36-37]。這表明Ttcysb可能參與調節水蛭內組織蛋白酶的活性，并在水蛭的免疫應答調節中起重要作用。

1.3 七鰓鰻cystatin家族成員功能研究進展

七鰓鰻隸屬于圓口綱，具有獨特的半寄生生活習性。2016～2018年，李博文和Zhu等對不同進食時間的中國東北七鰓鰻（Lampetra morii）口腔腺分泌液進行比較蛋白質組學研究，從中鑒定出半胱氨酸蛋白酶抑制劑F（L.moriicystatin F，Lmcystatin F）基因。由于Lm-cystatin F僅存在于進食后東北七鰓鰻的口腔腺分泌液中，因此推測Lm-cystatin F可能參與調控了東北七鰓鰻的吸血進食以及免疫防御等過程[38-39]。序列分析表明來自東北七鰓鰻口腔腺的Lm-cystatin F含有信號肽和二硫鍵等特征，隸屬于Ⅱ型cystatins家族。前21位氨基酸為信號肽（MSRVASLSLLLCGLCYFCCEA），29（P）～139（Q）位氨基酸為cystatin樣功能結構域。三維模擬結果表明Lm-cystatin F含有L1和L2等2個成環結構，2對二硫鍵，包含1個α螺旋和5個β折疊[38-39]。

重組Lm-cystatin F以劑量依賴性的方式抑制木瓜蛋白酶的活性，因此，李博文和Zhu等推測Lm-cystatin F具有cystatin超家族成員典型的生物學功能。此外，重組Lm-cystatin F能夠抑制人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）增殖、黏附于多種細胞外基質蛋白質、遷移、浸潤以及體外小管形成，因而具有抗血管新生功能[39]。

2 蛇毒cystatin超家族成員功能研究進展

cystatins是存在于蛇毒中的一類具有多種生物活性的小分子蛋白質[40]。目前，蛇毒來源的cystatin超家族成員均隸屬于Ⅱ型cystatins家族。1987年，Evans等首次從鼓腹咝蝰（Bitis arietans）蛇毒中分離得到cystatin超家族成員，將其名命為puff-adder[41]。隨后，Michele等從臺灣眼鏡蛇（Naja naja atra）毒液中分離出一種新的Ⅱ型cystatins家族成員，命名為眼鏡蛇半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cobra cystatin）[42]。序列分析表明cobra cystatin與puff-adder具有73%的同源性。酶活實驗表明puff-adder和cobra cystatin均能抑制木瓜蛋白酶和組織蛋白酶B的活性[41-42]。由于前期研究證實抑癌基因cystatin M（人源）也可以同樣特異性地抑制半胱氨酸蛋白酶中組織蛋白酶B的活性，且其表達若發生下調則會通過增強組織蛋白酶B的活性進而促進癌細胞的浸潤和轉移[43]，因此研究人員推測蛇毒cystatin超家族成員也很有可能參與調控腫瘤的發生及發展進程。

2002年，陳兵發現來自中華眼鏡蛇（Naja atra）蛇毒的小分子cystatin（snake venom cystatin，sv-cystatin）可顯著競爭性抑制木瓜蛋白酶和組織蛋白酶B的活性。氨基酸序列分析結果提示svcystatin與人源cystatin M具有高度相似性，因此陳兵推測sv-cystatin可能具有抗腫瘤侵襲及轉移的潛在功能[44]。由于蛇毒中sv-cystatin的含量相對較少，且其分離提純步驟過于繁瑣，因此宋軍及萬榕等先后通過構建pET-42a/GST-cystatin原核表達載體，并經大腸桿菌原核表達獲得可溶性重組sv-cystatin；構建pcDNA3.1/sv-cystatin真核表達載體，并經脂質體轉染導入相關癌細胞；以及運用巴斯德畢赤酵母真核表達體系表達重組svcystatin等方法來大批量生產、純化該蛋白，從而進一步了解sv-cystatin的多種生物學功能和潛在的作用機制[45-47]。除了能夠抑制半胱氨酸蛋白酶中木瓜蛋白酶和組織蛋白酶B的活性，體外及體內實驗均證實利用以上2種表達方法（大腸桿菌原核表達和巴斯德畢赤酵母真核表達）而得到的重組sv-cystatin均可有效抑制小鼠黑色素瘤B16F10及肝癌MHCC97H細胞的侵襲和轉移。與重組sv-cystatin結果相似，sv-cystatin轉染至B16F10及MHCC97H細胞后均可在體外及體內抑制上述腫瘤細胞的侵襲和轉移[48-51]。目前大量研究發現，腫瘤細胞可分泌多種蛋白水解酶，如半胱氨酸蛋白酶，并通過對細胞外基質以及基底膜的降解，從而在腫瘤的侵襲及轉移過程中發揮非常重要的作用[52]。因此，侵襲和轉移是惡性腫瘤的主要生物學特征，同樣也是導致腫瘤患者死亡的主要原因。而sv-cystatin作為半胱氨酸蛋白酶的有效抑制劑，可能通過阻礙半胱氨酸蛋白酶對細胞外基質和基底膜的降解，從而有效抑制腫瘤的侵襲與轉移。因此，謝群等提出sv-cystatin可作為抗癌治療的潛在候選藥物[48-51]。

研究發現腫瘤轉移抑制基因NM23（non-metastasis 23）可編碼生成核苷二磷酸激酶（nucleoside diphosphate kinases，NDPK）。作為目前研究較多的抑制腫瘤轉移的蛋白質，NDPK最早從小鼠黑色素瘤細胞中篩選得到，其在低轉移細胞株中的表達強度是高轉移細胞株內的10倍。目前研究證實NDPK可以結合多種小G蛋白和三聚體G蛋白，并抑制G蛋白水解三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）為二磷酸鳥苷（guanosine diphosphate，GDP），從而抑制蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）膜轉位，由此發揮其抑制腫瘤侵襲和轉移的作用。另外，NDPK還可與微管蛋白結合，通過調節微管結構而影響細胞結構和遷移，進而抑制腫瘤細胞侵襲和轉移[53-54]。2011年，齊元麟等發現sv-cystatin能夠顯著上調小鼠黑色素瘤細胞中NM23的表達，并由此推斷sv-cystatin可能通過調控NM23的表達來抑制腫瘤的侵襲及轉移[55]。

2013年，謝群等在體外實驗中發現重組svcystatin處理人肝癌MHCC97H細胞后，可下調MHCC97H細胞內轉化生長因子β2（transforming growth factor-β2，TGF-β2）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的轉錄水平及蛋白表達。由于TGF-β2是一類多功能的細胞因子，在腫瘤的發生、發展中發揮重要的促進作用，因此sv-cystatin處理MHCC97H細胞后，可通過抑制TGF-β2的轉錄和表達，進而阻礙TGF-β2與其受體的結合，最終阻斷其胞內下游Smads信號轉導通路，從而抑制腫瘤的轉移；同時，sv-cystatin還可通過抑制TGF-β2介導的上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），從而抑制腫瘤的發生發展[56-57]。此外，TNF-α可與細胞內血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）以及血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）等細胞生長因子協同作用來誘導腫瘤形成新血管。并且，目前TNF-α已經成為抗血管生成作用的有效靶點而用于腫瘤治療[58]。因此，sv-cystatin還可通過下調TNF-α的轉錄和表達來發揮其抗血管新生作用，從而抑制腫瘤的生長。

目前，研究發現血管在腫瘤生長和轉移過程中發揮了非常重要的作用。不過，僅僅依賴于內皮細胞形成的血管是無法滿足腫瘤生長過程中所需要的血液供應。最近研究發現，在惡性腫瘤組織中，腫瘤細胞可通過自身變形，并與細胞外基質相互作用，以模擬血管壁結構而形成由一層腫瘤細胞而不是由內皮細胞構成的擬態血管（血管生成擬態，vasculogenic mimicry，VM）。由于VM為腫瘤的生長和轉移提供了更為充足的血液供應，因此VM在多種惡性腫瘤組織中均有發現，如卵巢癌、肝癌及胃癌等[59]。與未出現VM的腫瘤細胞相比，在VM周圍的多種腫瘤細胞中，基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2與MMP9的含量都相對較高。MMPs是一組Zn2+依賴性肽酶，能夠降解多種細胞外基質以及基底膜中多種膠原成分，包括層粘連蛋白、纖維連接蛋白、彈力蛋白及蛋白聚糖等，因此MMPs在腫瘤侵襲、轉移及血管生成中發揮著至關重要的作用[60-62]。2010年，Robertson等發現在形成VM的乳腺癌細胞中，MMP2和MMP9的蛋白含量明顯高于未出現VM的乳腺癌細胞[63]。由此表明MMP2和MMP9與VM的形成有緊密關系。2011年，Tang等發現sv-cystatin基因轉染至肝癌MHCC97H細胞后可以抑制MMP2與MMP9的活性，因此推測sv-cystatin可能是通過抑制肝癌MHCC97H細胞內MMP2和MMP9的活性從而減少其對細胞外基質的降解，進而減少VM的形成，最終抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移[50]。除了形成VM，腫瘤細胞還可分泌大量血管生長因子，通過激活血管內皮細胞信號傳導通路，導致血管內皮細胞的異常增殖，最終形成提供營養供給的新生血管。例如，VEGF和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是2種重要的血管生長刺激因子，可同內皮細胞上血管內皮生長因子受體（fms-like tyrosine kinase，flt-1）結合，通過激發內皮細胞信號轉導途徑，從而促進內皮細胞的增殖、遷移、細胞外基質的降解以及侵襲基底膜，最終形成新的血管。2013年，Xie等研究表明重組sv-cystatin還能明顯抑制小鼠黑色素瘤B16F10細胞和肝癌MHCC97H細胞分泌VEGF和bFGF，并顯著抑制內皮細胞HUVECs中flt-1的表達，從而最終抑制腫瘤內新血管的生成[64]。

此外，謝群等還發現重組sv-cystatin可以通過誘導肝癌MHCC97H和小鼠黑色素瘤B16F10細胞發生凋亡來抑制腫瘤的生長。重組sv-cystatin促使MHCC97H及B16F10細胞釋放活性氧，并通過活化caspase-2來破壞線粒體功能，即將線粒體內的細胞色素C（cytochrome C）釋放至細胞質中。細胞色素C的釋放是線粒體凋亡路徑的重要一環。被釋放入細胞質的細胞色素C通過自我剪切可以活化并啟動caspase級聯反應，從而激活其下游的凋亡執行者caspase-3，最終引起細胞凋亡。另外，Western印跡分析表明重組sv-cystatin還能抑制抗凋亡基因BCL2的表達，并同時促進促凋亡基因BAX的表達。BCL2和BAX作為線粒體凋亡途徑上的重要調控蛋白，相互結合、彼此抑制，共同影響細胞凋亡的發生與發展[48]。因此，上述結果意味著sv-cystatin可通過線粒體途徑誘導MHCC97H和B16F10細胞凋亡。

到目前為止，sv-cystatin是研究相對較多且較為深入的來自蛇毒的cystatin超家族成員。綜上所述，sv-cystatin抑制腫瘤細胞轉移機制為：svcystatin首先通過抑制半胱氨酸蛋白酶的活性從而抑制其對細胞外基質及基底膜的降解，最終抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲。其次，sv-cystatin還可通過上調NM23的表達，抑制腫瘤的侵襲及轉移。第三，sv-cystatin通過下調TGF-β2轉錄水平及蛋白的表達，抑制腫瘤細胞的轉移及上皮間質轉化。此外，sv-cystatin還可通過抑制腫瘤內VM及血管新生來阻斷腫瘤細胞的營養供給，其作用機制為：首先sv-cystatin可通過抑制MMP2和MMP9的活性，減少其對細胞外基質的降解，進而減少VM的形成；其次，sv-cystatin可通過下調TNF-α、VEGF、bFGF及flt-1受體的表達來抑制腫瘤內新生血管的形成。最后，sv-cystatin還可通過線粒體途徑誘導腫瘤細胞發生凋亡來抑制腫瘤的生長。因此，sv-cystatin有望成為具有抗腫瘤功能的新型候選藥物。

除了sv-cystatin，Richards等在2011年通過KM71H畢赤酵母表達系統重組表達了來自澳大利亞低地銅斑蛇（Australian lowland copperhead）蛇毒中的Ⅱ型cystatins成員AsCystatin，并預測其Mr為13 087。與人cystatin C相似，重組AsCystatin同樣可抑制組織蛋白酶B、L以及木瓜蛋白酶的活性[65]。不過，AsCystatin是否與sv-cystatin一樣具有多種生物學功能，還須進一步探索。

綜上所述，來源于吸血動物及蛇毒的cystatin成員隸屬于Ⅰ型和Ⅱ型cystatins家族，具有該家族典型的生物學功能，即能夠抑制多種半胱氨酸類蛋白酶的活性。同時，上述cystatins成員還能夠廣泛參與調節吸血動物的生長發育、寄生吸血、血液消化、應對宿主免疫調節以及抗腫瘤等功能。