Resolvin D2 通 過 抑 制NF- κB通路減輕病毒性心肌炎小鼠炎癥反應的研究

石哲瑋 劉勝新 張銀宇 丁可軍 秦鋮璠 陳瑩瑩 錢彩珍

病毒性心肌炎是指由于病毒感染引起心肌組織廣泛的炎癥病變，隨著疾病進展，可導致嚴重的心力衰竭以及惡性心律失常，甚至可導致年輕患者心源性猝死[1]。然而由于病毒性心肌炎的病理過程尚未完全闡明，臨床上仍以對癥支持治療為主。腺病毒、腸道病毒以及巨細胞病毒是最常見的感染源，其中柯薩奇B3 病毒（coxsackievirus B3，CVB3）是一種公認的具有誘導病毒性心肌炎的腸道病毒[2]。尋找能夠有效抑制CVB3 感染引起的心肌組織炎癥反應的藥物，可改善病毒性心肌炎患者的臨床癥狀并降低不良事件的發生率。消退素（resolvin，Rv）家族是一類人體自身合成的具有促進炎癥消退作用的新型多不飽和脂肪酸衍生物。Serhan 等[3]率先報道從動物炎癥消退過程中釋放的炎性滲出液中可分離得到Rv。近來的研究表明，Rv 在多種炎癥相關疾病，包括骨炎、牙周炎、急性胰腺炎等疾病的發生、發展中發揮著重要的保護作用[4-6]。Tian 等[7]的研究結果表明RvD2（resolvin D2，RvD2）作為Rv 家族成員之一能夠通過抑制核因子κB （nuclear factor-kappaB，NF-κB）通路下調脂多糖誘導的小膠質細胞炎癥反應，并改善神經性退行性疾病的臨床癥狀。本研究通過腹腔注射CVB3 病毒構建病毒性心肌炎動物模型，初步探討RvD2 能否通過Toll 樣受體（toll-like receptors，TLR）4 抑制NF-κB 通路從而下調病毒性心肌炎小鼠體內炎癥因子的表達，為病毒性心肌炎臨床治療方案的制定提供一定的理論和實驗依據，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及細胞、病毒株 健康清潔級雄性BALB/C 小鼠，體重（20±2）g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，動物生產許可證編號：SCXK（滬）2012-0002。雄性BALB/C 小鼠飼養在溫州醫科大學實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK（浙）2015-0009。Hep2 細胞由中國科學院上海生命科學院細胞資源中心提供。CVB3 Nancy 株購于美國ATCC 公司。病毒經Hep2 細胞活化增殖,細胞病理損傷達75%以上時收獲,其滴度為107TCID50/0.1ml。

1.2 試劑及儀器 RvD2 購于美國Cayman chemical公 司， 兔 抗 小 鼠 白 介 素（interleukin，IL）-1β（ab9722）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α（ab1793）和TLR4（ab22048）單克隆抗體均購于英國Abcam 公司；兔抗小鼠NF-κB（#8242）單克隆抗體購于美國CST 公司；兔抗小鼠p-NF-κB（BS4737） 單克隆抗體購于上海西寶公司；抗GAPDH（MB001）單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG 均購于美國Bioworld 公司；ELISA 檢測試劑盒購于上海博谷生物科技有限公司；HE 染色試劑盒、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液等均購于中國Solarbio 公司；ECL 顯色液購自美國Advansta 公司；其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純化、酶標儀購于美國Thermo Fisher Scientific 公司；垂直電泳儀購于美國BIO-RAD 公司；顯微鏡購于日本Olympus 公司。

1.3 方法

1.3.1 模型建立與分組 CVB3 經Hep2 細胞活化增殖，細胞病理損傷達75%以上時收獲，測定其滴度用于造模。采用隨機數字表法將40 只BALB/C 小鼠分為4 組：正常對照組、RvD2 對照組、心肌炎組、RvD2 治療組。正常對照組給予腹腔注射0.2ml0.9%氯化鈉溶液。除正常對照組和RvD2 對照組外其余各組均采用腹腔接種1.0×106滴度CVB3 0.2ml 建立病毒性心肌炎動物模型。RvD2 對照組小鼠給予RvD2 腹腔注射給藥，RvD2 治療組小鼠在腹腔接種CVB3 24h 后給予RvD2 腹腔注射給藥，RvD2 劑量均為0.25ng/g，1 次/d，持續7d。于治療7d 后通過注射過量水合氯醛處死小鼠，留取血清標本，立即開胸摘取心臟，放入PBS 中，將心腔內的血擠干凈，切取心尖部心肌組織用4%多聚甲醛固定，剩余心肌組織儲存于-80℃冰箱內。

1.3.2 IL-1β、TNF-α 水平檢測 將正常對照組、RvD2 對照組、心肌炎組和RvD2 治療組小鼠處死后立即摘除眼球取血，將全血在室溫下放置1h，待全血自然凝固并析出血清后，放入離心機內，4℃2 000g 離心10min，待離心完成后吸取黃色上清液，將待測血清存放于-80℃冰箱內保存。按照ELISA 檢測試劑盒中的說明書步驟依次檢測小鼠血清IL-1β、TNF-α 水平。1.3.3 心肌組織炎癥細胞浸潤情況評分 切取正常對照組、RvD2 對照組、心肌炎組和RvD2 治療組小鼠心尖部心肌組織并用4%多聚甲醛固定24h。固定過程結束后用清水沖洗殘留的多聚甲醛，經梯度脫水、石蠟包埋、固定，然后行石蠟切片。按照HE 染色試劑盒中的實驗步驟染色，染色后光鏡下觀察各組心臟組織炎癥細胞浸潤情況。請本院病理科醫生根據半定量評分標準對病理切片中炎癥細胞浸潤情況進行評分，無病變計0 分，病變累及心?。?5%計1分，25%～＜50%計2 分，50%～＜75%計3 分，75%～100%計4 分。

1.3.4 心肌組織內IL-1β、TNF-α、TLR4、NF-κB、p-NF-κB 和GAPDH 蛋白表達測定 留取心尖部心肌組織后，稱量剩余心肌組織并放入裝有適當體積裂解液（含蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑）的勻漿管中，通過勻漿機裂解心肌組織，冰上裂解30min，離心后超聲破碎3 次，放入離心機內12 000g、4℃離心30min 后取上清液通過考馬斯亮藍染色法測定蛋白濃度，準備蛋白樣品。用10%SDS-PAGE 膠分離后，300mA 轉膜，用5%脫脂奶粉封閉2h，加入抗IL-1β、TNF-α、TLR4、NF-κB、p-NF-κB 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）蛋白Ⅰ抗中4℃孵育過夜，第2天用TBS-Tween 洗滌3 次后，孵育于Ⅱ抗中2h，再次洗滌3 次，加ECL 液曝光、顯影、定影。用掃描儀掃描曝光膠片，用Image Lab 軟件分析條帶灰度值。IL-1β、TNF-α、TLR4 以GAPDH 蛋白作為參照，檢測蛋白表達水平；p-NF-κB 以NF-κB 蛋白作為參照，檢測蛋白磷酸化水平。

1.4 統計學處理 采用SPSS22.0 統計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4 組小鼠血清IL-1β、TNF-α 水平比較 見表1。

由表1 可見，4 組小鼠血清IL-1β、TNF-α 水平差異均有統計學意義（均P＜0.05）。正常對照組與RvD2 對照組小鼠血清IL-1β、TNF-α 水平差異均無統計學意義（均P＞0.05）；與正常對照組相比，心肌炎組小鼠血清IL-1β、TNF-α 水平增加（均P＜0.05）；與心肌炎組相比，RvD2 治療組小鼠血清IL-1β、TNF-α 水平降低（均P＜0.05）。

表1 4 組小鼠血清IL-1β、TNF-α 水平比較

2.2 4 組小鼠心肌組織炎癥細胞浸潤情況比較 見圖1。

由圖1 可見，與正常對照組比較，RvD2 對照組小鼠心肌組織內無炎癥細胞浸潤，評分為0 分，差異無統計學意義（P＞0.05）；與正常對照組比較，心肌炎組小鼠心肌組織內有大量炎癥細胞浸潤（評分2.5分），差異有統計學意義（P＜0.05）；與心肌炎組相比，RvD2 治療組小鼠心臟組織內炎癥細胞浸潤明顯下調（評分1.3 分），差異有統計學意義（P＜0.05）。2.3 4 組小鼠心肌組織內炎癥因子IL-1β、TNF-α蛋白表達水平比較 見圖2。

由圖2 可見，4 組小鼠心肌組織內炎癥因子IL-1β、TNF-α 蛋白表達水平差異均有統計學意義（均P＜0.05）。正常對照組與RvD2 對照組小鼠IL-1β、TNF-α 蛋白表達水平差異均無統計學意義（均P＞0.05）；與正常對照組相比，心肌炎組小鼠IL-1β、TNF-α 蛋白表達水平顯著上調（均P＜0.05）；與心肌炎組相比，RvD2 治療組小鼠IL-1β、TNF-α 蛋白表達水平顯著下調（均P＜0.05）。

2.4 4 組小鼠心肌組織內TLR4 蛋白表達水平及NF-κB 蛋白磷酸化水平比較 見圖3。

由圖3 可見，4 組小鼠心肌組織內TLR4 蛋白表達水平及NF-κB 蛋白磷酸化水平比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常對照組相比，RvD2 對照組小鼠心肌組織內TLR4 蛋白表達水平和NF-κB 蛋白磷酸化水平差異無統計學意義（均P＞0.05）；與正常對照組相比，心肌炎組小鼠心肌組織內TLR4蛋白表達水平和NF-κB 蛋白磷酸化水平顯著上調（均P＜0.05）；與心肌炎組相比，RvD2 治療組小鼠心臟組織內TLR4 蛋白表達水平和NF-κB 蛋白磷酸化水平顯著下調（均P＜0.05）。

圖1 4 組小鼠心肌組織內炎癥細胞浸潤情況比較（A：4 組小鼠心肌組織病理染色圖，HE 染色，×200；B：4 組小鼠心肌組織炎癥細胞浸潤情況評分，與正常對照組比較，*P＜0.05；與心肌炎組比較，△P＜0.05）

3 討論

病毒性心肌炎是指由于病毒感染引起的心肌局限性或彌漫性的炎癥性病變，屬于感染性心臟疾病。目前尚無特異性治療方法，臨床上主要以抗病毒和對癥支持治療為主。雖然現有的抗病毒治療可有效控制病毒擴增，但是在抑制心臟炎癥方面現有的臨床藥物尚不能發揮滿意的療效。因此，尋找能夠有效改善病毒性心肌炎患者體內炎癥反應的藥物，有利于改善病毒性心肌炎患者的臨床癥狀和遠期預后。

圖2 4 組小鼠心肌組織內炎癥因子TNF-α、IL-1β 蛋白表達水平比較（A：TNF-α、IL-1β 和GAPDH 蛋白電泳圖；B：4 組小鼠心肌組織內TNF-α 蛋白表達水平比較；C：4 組小鼠心肌組織內IL-1β 蛋白表達水平比較。與正常對照組比較，*P＜0.05；與心肌炎組比較，△P＜0.05）

Rv 家族在不同疾病過程中發揮重要的保護作用。RvD2 作為消退素家族重要成員之一，是在炎癥消退期間由白細胞產生的脂質介質，可以調節從炎癥反應直至組織修復的全過程[11]，且在不同疾病過程中發揮重要的保護作用。Croasdell 等[12]研究指出RvD2 能夠減弱脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的炎癥反應。Charles 等[13]的研究表明RvD2 可增強吞噬介導的細菌清除以及器官保護作用。Spite 等[14]的研究發現RvD2 可以保護膿毒癥小鼠免受白細胞浸潤和細胞因子過度生成而造成的組織損傷，同時增強機體清除微生物的能力，從而減少敗血癥引起的小鼠死亡。本研究結果表明，給予病毒性心肌炎小鼠RvD2 治療可以顯著減少心肌組織內炎癥細胞浸潤，并抑制病毒性心肌炎小鼠血清和心肌組織內炎癥因子IL-1β 和TNF-α 的表達?？赡苁怯捎赗vD2 是一種有效的內源性抗炎介質[15]，因此相較于其他體外合成的化學藥物，這種新的治療方法可以減少藥物對宿主身體機能的影響，治療上具有更大的潛力。

圖3 4 組小鼠心肌組織內TLR4 蛋白表達水平及NF-κB 蛋白磷酸化水平比較（A：TLR4、p-NF-κB、NF-κB 和GAPDH 蛋白電泳圖；B：4 組小鼠心肌組織內TLR4 蛋白表達水平比較；C：4 組小鼠心肌組織內NF-κB 蛋白磷酸化水平比較。與正常對照組比較，*P＜0.05；與心肌炎組比較，△P＜0.05）

既往的研究表明，RvD2 可以通過RvD2/DRV2軸激活細胞內的信號通路增強巨噬細胞對細菌的清除能力[13]，通過下調TLR4 受體表達從而抑制LPS 誘導的炎癥反應[12]，還可通過與其受體G 蛋白偶聯受體18（G protein coupled receptor 18，GPR18）結合從而增強血管內皮細胞的遷移能力[14]。為了明確RvD2 在病毒性心肌炎小鼠體內發揮抗炎作用的具體機制，本課題組進一步檢測了炎癥通路相關蛋白的表達。本研究結果表明，RvD2 治療可顯著下調TLR4 蛋白表達以及NF-κB 蛋白磷酸化水平。由此可見，RvD2 對病毒性心肌炎小鼠體內炎癥因子表達的調控作用可能與TLR4/NF-κB 信號通路相關。

在本實驗中，我們通過腹腔注射CVB3 病毒構建急性病毒性心肌炎動物模型，RvD2 對照組和RvD2 治療組每日均給予相同劑量的RvD2 腹腔注射治療。ELISA 檢測結果表明RvD2 可以有效抑制心肌炎小鼠血清中炎癥因子表達。HE 染色以及炎癥因子IL-1β、TNF-α 蛋白檢測結果表明RvD2 可以有效緩解心肌炎小鼠心臟組織內炎癥反應。與此同時，RvD2 治療后心肌炎小鼠心臟組織內TLR4 蛋白表達水平以及NF-κB 蛋白磷酸化水平均明顯下調。RvD2 可能通過抑制TLR4/NF-κB 信號通路進而降低病毒性心肌炎小鼠體內的炎癥反應，最終改善病毒性心肌炎小鼠的預后。RvD2 對病毒性心肌炎小鼠炎癥反應的抑制作用為相關抗炎藥物的研發提供了理論和實驗基礎，有望改善病毒性心肌炎患者的臨床癥狀和遠期預后。

本實驗的局限之處是未設立NF-κB 蛋白激動劑處理組。在研究抗炎機制方面，雖然發現RvD2 能夠抑制NF-κB 蛋白磷酸化，但是尚不能完整證明RvD2 是通過NF-κB 信號通路下調心肌炎癥反應。因此，RvD2 對病毒性心肌炎小鼠心臟組織炎癥反應的保護作用機制還有待進一步研究。