土鱉蟲活性肽組分對急性血瘀模型大鼠血液流變學、血脂四項指標及血液因子含量的影響

姜 珊 王少平 代 龍 張加余 高 鵬 劉子菡 王喻淇

(1. 濱州醫學院，山東 煙臺 264003； 2. 山東中醫藥大學，山東 濟南 250300；3. 北京中醫藥大學，北京 102488)

土鱉蟲為鱉蠊科昆蟲地鱉或冀地鱉的雌蟲干燥體，為中醫臨床傳統用藥。其最早記載于《神農本草經》[1]，又稱土元、土鱉子、地烏龜，能活血逐瘀、續筋接骨，臨床主要用于跌打損傷、筋損骨折、血瘀經閉以及產后血瘀腹痛等癥[2]。土鱉蟲蛋白質含量占總蟲體質量的60%，且所含的氨基酸種類完整，幾乎包括構成蛋白質的所有氨基酸[3]。但是，大分子蛋白無法被人體吸收，只能經過胃腸道蛋白消化酶的作用轉變為小分子活性肽后方能發揮藥效[4-7]。仿生酶解動物蛋白制備的活性物質主要以小肽或寡肽形式存在，被認為是動物類中藥真正起效的物質基礎[8-10]。

中醫“血瘀證”是一類疾病的統稱，主要包括高血脂、高血壓、血管狹窄、動脈粥樣硬化和腦血栓等病癥。其病理表現為全血黏度上升、血細胞壓積升高、血小板聚集性增強、電泳時間加長、血管功能失調、促血管生成因子減少、自由基增加和局部組織缺血造成壞死等[11-12]。

據報道[13]，土鱉蟲體內含有具有纖溶活性的物質，具有顯著的活血化瘀功效。目前大部分研究[14-16]是關于土鱉蟲干粉和土鱉蟲蛋白質具有纖溶活性的報道，土鱉蟲乙醇(水)提取物均可以改善大鼠機體凝血因子、抗氧化/氧化因子的水平，并促進血管生成。韓雅莉等[17]從地鱉蟲中分離出3種具有纖溶活性的蛋白質EFF1、EFF2和EFF3，其中EFF2活性最強。而土鱉蟲活性肽是由土鱉蟲蛋白質經仿生酶解而來，結合蛋白質體內消化過程，推斷土鱉蟲活性肽具有纖溶活性。但是以土鱉蟲活性肽為材料研究其對“血瘀證”的作用機制未見報道。同時對于土鱉蟲活性肽中存在的活性小肽組分也沒有明確信息。

試驗擬以土鱉蟲活性肽為研究材料，基于多種分離方式聯合檢測手段并行的原則，分離純化獲得土鱉蟲活性肽組分，并探討分離組分對急性血瘀模型大鼠血液流變學、血脂四項指標及血液因子含量的影響，為動物藥治療血瘀證提供新的研究思路和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

土鱉蟲藥材：中華冀地鱉[Steleophagaplancyi(Boleny)]，山東省長清土元養殖公司；

SD大鼠：8周齡，體重180～200 g，許可證號SCXK(魯)20140007，山東濟南朋悅實驗動物有限公司；

凝血酶：500 U/g，深圳生化制劑廠；

牛血纖維蛋白原：純度95.3%，沈陽拜英生物科技有限公司；

胃蛋白酶(2 500 U/mg)、胰蛋白酶(5 000 U/mg)：上海國藥試劑集團有限公司；

大孔吸附樹脂：DA201-C型，滄州寶恩樹脂有限公司；

Sephadex G25：南京?？藸柹锟萍加邢薰?；

T-CHO、TG、HDL和LDL試劑盒：南京建成生物工程研究所有限公司；

NO、SOD、t-PA和FIBELISA試劑盒：上海酶聯生物科技公司。

1.2 儀器與設備

恒溫培養箱：BPH-9082型，上海一恒科學儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-601型，鎮江瑞祥儀器有限公司；

十萬分之一天平：MS104型，梅特勒—托利多國際貿易(上海)有限公司；

超聲振蕩儀：KQ2200DV型，杭州法蘭特超聲波科技有限公司；

全自動血細胞分析儀：LH 750型，貝克曼庫爾特中國儀器公司；

恒溫旋轉儀：N-1100VEYeLa型，日本東京理化儀器公司；

多功能電導儀：FE30型，梅特勒—托利多(上海)精密儀器公司；

小型電滲析儀：LH320型，遼寧金科水處理有效公司；

膜處理設備：DKH-43型，上海陶氏膜處理集團。

1.3 方法

1.3.1 土鱉蟲活性肽的制備 根據課題組[18]前期的研究，取土鱉蟲藥材(過80目篩)500 g，加10倍量去離子水，加熱至沸，放至室溫。用稀鹽酸調pH至2.0，加1%胃蛋白酶，37 ℃酶解1.0 h；再用氫氧化鈉溶液調pH至9.0，加1%胰蛋白酶，酶解3.0 h后加熱滅酶15 min，放涼后冷藏12 h，離心，收集上清液。調整上清液濃度到500 mg/mL，pH值至6.5，分裝入電滲析儀器內，平衡15 min 后進行除鹽操作2.5 h，收集土鱉蟲活性肽溶液，備用。

1.3.2 纖溶活性測定 采用尿激酶為對照藥物進行體外纖溶活性測定[19]，以溶圈面積為縱坐標，尿激酶活力(U)的對數為橫坐標進行線性回歸，建立標準曲線。

1.3.3 土鱉活性肽的分離純化

(1) 超濾和納濾分離：取土鱉蟲活性肽溶液，用截留分子量為3 kDa的超濾膜和截留分子量為1 kDa納濾膜進行分段，收集分子量>3，1～3，<1 kDa的酶解液，經冷凍干燥后進行纖溶活力測定，篩選出纖溶活力最高的組分。

(2) DA201-C型大孔吸附樹脂分離：根據文獻[20]修改如下，將1.3.3(1)獲得的纖溶活性最高的組分離心過濾后，調整pH值至6.0，上樣質量濃度為20 mg/mL，上樣體積為0.02 BV，上樣流速2 BV/h；上樣結束后吸附3 h。再依次用去離子水、25%乙醇溶液、50%乙醇溶液、75%乙醇溶液進行洗脫，收集各洗脫液后分別凍干后測定纖溶活性。

(3) 葡聚糖凝膠G-25分離：將1.3.3(2)獲得的纖溶活性最高的組分用去離子水溶解后上樣，上樣質量濃度為10 mg/mL，上樣體積為0.02 BV，用去離子水進行洗脫，流速為0.2 mL/min，每1.0 mL收集一試管，采用可見—紫外分光光度儀檢測每個試管在220 nm下的吸光度(A)，至最后幾個試管的吸光度和去離子水相同時停止洗脫。將各洗脫峰分別凍干并測定纖溶活性。

(4) RP-HPLC分離：將1.3.3(3)獲得的纖溶活性最高組分采用RP-HPLC進行分離純化。色譜條件：色譜柱為Agilent BOZAX300SB-C18肽色譜柱；檢測波長220 nm；流速1.0 mL/min；流動相A為乙腈(含0.1%三氟乙酸)，流動相B為純水(0.1%三氟乙酸)，梯度洗脫方法為0～50 min，95% B～50% B；50～65 min，50% B～95% B；進樣量50 μL。對各洗脫峰進行制備，凍干后進行纖溶活性測定。

1.3.4 土鱉蟲活性肽對急性血瘀模型大鼠的影響

(1) 急性血瘀大鼠造模及給藥：根據文獻[21]修改如下，90只雄性SD大鼠適應性飼養7 d后隨機分為5組，即空白組、模型組、尿激酶陽性組、土鱉活性肽組分F2高劑量組、土鱉活性肽組分F2低劑量組。除空白組以外，其他組大鼠每天定量給予50 g高脂飼料和4.0 mL高脂乳劑，空白組大鼠給予普通飼料，持續45 d。同時，用高脂飼料和高脂乳劑飼養15 d后，每只老鼠肌肉注射0.2 mL 鹽酸腎上腺素注射液(除空白組)。注射30 min后冷水浴(4 ℃)15 min，持續30 d造模。按照體表面積方法計算，尿激酶組給藥劑量1.0×105U/kg，土鱉活性肽組分F2高、低劑量組按照預試驗結果確定的給藥濃度分別為50，25 mg/kg，模型組和空白組給予生理鹽水。所有樣品均用生理鹽水溶解，肌內注射給藥15 d，給藥期間持續給予高脂飼料。

(2) 血液取樣：末次給藥5 h后，于大鼠腹主動脈取血3.0 mL，注入肝素鈉的玻璃硅化管內，離心取血漿；同時取5.0 mL血液注入未加入抗凝劑的EP管，離心取血清。

(3) 生化指標測定：采用全血液自動分析儀、血流變分析儀對各組大鼠血漿進行血液流變指標檢測，并測定血清中HDL/LDL、TG、T-CHO、SOD、NO、t-PA和FIB的含量。

1.4 數據統計與分析

所有數據采用SPSS 20.0和Graphpad Prism進行處理，試驗數據為3個平行樣品的平均值，以Mean±SD表示，LSD檢驗兩兩比較；若方差不齊，檢驗其差異性則采用H-G檢驗。

2 結果與分析

2.1 纖溶活性測定標準曲線

以溶圈面積為縱坐標，尿激酶活力的對數為橫坐標得到的線性方程為Y=1.564X-1.863 5，R2=0.997 2，線性范圍為1.337 6～5.987 1 cm2。

圖1 標準曲線測定結果Figure 1 Standard curve measurement results

2.2 土鱉活性肽分離純化

2.2.1 超濾和納濾分離的活性肽 超濾試驗結果表明，分子量>3 kDa活性肽溶液無纖溶活性，而分子量<3 kDa 活性肽溶液具有明顯活性，因此對分子量<3 kDa活性肽溶液進行納濾分離。如表1所示，分子量1～3 kDa 活性肽溶液和分子量<1 kDa活性肽溶液均有纖溶活性，但是分子量1～3 kDa活性肽溶液纖溶活性更強，對結果進行分析得出：<1 kDa活性肽溶液多為游離氨基酸，氨基酸并不能直接發揮活性作用，而>3 kDa活性肽溶液多為滅活后殘留的胰蛋白酶、胃蛋白酶，幾乎沒有活性。1～3 kDa活性肽溶液多為活性肽集中存在區域，故選定該分子質量范圍的酶解液進行分離純化。

表1超濾和納濾分離土鱉蟲活性肽溶液纖溶活力
Table 1 Determination of fibrinolytic activity ofE.steleophagaactive peptide solution obtained by ultrafiltration and nanofiltration

土鱉活性肽溶液分子量/kDa溶圈面積/cm2活力/(U·g-1)>30.00000.00<31.53942997.76<11.10531582.121～32.00615959.35

2.2.2 DA201-C型吸附樹脂、葡聚糖凝膠G-25和RP-HPLC分離的活性肽 DA201-C型吸附樹脂處理后的去離子水洗脫液纖溶活性為0，可直接舍棄；其他3個洗脫組分的纖溶活性順序為50%乙醇洗脫液(13 159.89 U/g)>25%乙醇洗脫液(4 107.95 U/g)>75%乙醇洗脫液(515.87 U/g)。說明DA201-C樹脂分離的活性較強的肽多為中等極性。然后采用葡聚糖凝膠G-25對50%乙醇洗脫液進行分離純化，獲得的P1、P2和P3洗脫峰(圖2)的纖溶活性分別為1 674.33，62 044.61，8 615.63 U/g，因此選定活性最強的P2洗脫組分繼續分離純化。由圖3可知，經過RP-HPLC色譜柱分離后，可獲得5個色譜峰(F1～F5)。其中，F2的纖溶活性(167 808.97 U/g)遠大于其他峰，故選擇土鱉蟲生物活性肽F2進行藥理試驗。

2.3 土鱉蟲活性肽組分F2對急性血瘀模型大鼠影響

2.3.1 血細胞、血液流變指標 如表2所示，尿激酶組大鼠紅細胞壓積、血小板計數明顯降低，并與模型組比較具有顯著性差異，說明尿激酶可以明顯改善血液流動。土鱉蟲活性肽組分F2高、低劑量組也具有使兩項指標降低的作用，其中高劑量組與模型組差異顯著(P<0.05)。對表3中血流變試驗結果分析得出，尿激酶組對其改善效果較佳且與模型組比較具有極顯著性差異(P<0.01)。土鱉蟲活性肽組分F2高、低劑量組均能降低急性“血瘀證”大鼠在高、中、低切度下的血流變值，且與模型組相比具有極顯著性差異(P<0.01)，說明土鱉蟲活性肽組分F2具有改善急性“血瘀證”大鼠的血液流變指標的作用。土鱉蟲活性肽組分F2高、低劑量組除低切下具有差異外，其他切度下沒有顯著性差異，說明治療效果和劑量間沒有關系。

圖2 葡聚糖凝膠G-25層析分離純化結果Figure 2 Sephadex gel G-25 chromatography separation and purification results

圖3 RP-HPLC分離圖譜Figure 3 RP-HPLC liquid phase separation spectrum

2.3.2 血脂四項指標的檢測 由圖4可知，經過長期給予高脂喂養后，模型組大鼠血液內TG、T-CHO、HDL-C和LDL-C的含量較空白組明顯上升，具有極顯著性差異著性差異(P<0.01)。陽性藥物尿激酶組明顯降低大鼠血液內TG、T-CHO、HDL-C和LDL-C的含量。土鱉蟲活性肽組分F2高、低劑量給藥后，血脂四項均有下降趨勢，與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05)。說明土鱉蟲活性肽可下調高脂血大鼠血液內TG、T-CHO、HDL-C和LDL-C的含量。土鱉蟲活性肽組分F2高、低劑量組之間差異不顯著，說明治療效果和劑量間相關性不明顯。

表2 血細胞檢測結果?Table 2 Blood cell test results

? **. 與空白組比有極顯著性差異(P<0.01)；△. 與模型組比有顯著性差異(P<0.05)，△△. 與模型組比有極顯(P<0.01)。

表3 血液流變指標檢測結果?Table 3 Blood rheology index test results

? **. 與空白組比有極顯著性差異(P<0.01)；△. 與模型組比有顯著性差異(P<0.05)，△△. 與模型組比有極顯著性差異(P<0.01)；●. 與低劑量組比有顯著性差異(P<0.05)。

2.3.3 血液因子含量的測定 如圖5所示，血清SOD含量測定結果表明，造模后模型組大鼠血清中SOD含量降低，只有(15.511 1±0.884 3) μmol/mL，與空白組比具有極顯著差異(P<0.01)。連續給藥后，尿激酶組和土鱉蟲活性肽組分F2高、低劑量組大鼠血清中SOD含量均升高。其中，土鱉蟲活性肽組分F2高劑量組與模型組大鼠相比具有極顯著性差異(P<0.01)。

1. 空白組 2. 模型組 3. 尿激酶組 4. F2高劑量組 5. F2低劑量組 *. 與空白組相比有顯著性差異(P<0.05) **. 與空白組相比有極顯著差異(P<0.01)圖4 各樣本血清HDL、LDL、TG和T-CHO含量測定結果Figure 4 Results of serum HDL, LDL, TG and T-CHO determination in each sample

1. 空白組 2. 模型組 3. 尿激酶組 4. F2高劑量組 5. F2低劑量組 *. 與空白組相比有顯著性差異(P<0.05) **. 與空白組相比有極顯著差異(P<0.01) △△. 與模型組比有顯著性差異(P<0.05) ●. 與尿激酶組比有顯著性差異(P<0.05) ●●. 與尿激酶組比有極顯著差異(P<0.01)圖5 各樣本血清SOD、NO、FIB和t-PA含量測定結果Figure 5 Results of determination of serum SOD, NO, FIB and t-PA in each sample

NO在體內作為血管擴張機動因子，主要起到擴張血管、降低血壓、降低血黏度作用，為血瘀證改善的主要評價指標。血清中NO含量結果表明，急性血瘀證模型組大鼠血清NO含量比空白組大鼠NO含量降低明顯，具有極顯著性差異(P<0.01)；連續給藥治療15 d后，各組大鼠血清NO含量均有升高，除尿激酶組外，其他各組與模型組均具有顯著性差異(P<0.05)?？紤]到尿激酶屬于直接纖溶劑，并不具有調節血清NO功能。

血液內t-PA含量下降，造成FIB含量增加，使得大鼠具有形成血栓的潛在危險性。連續給藥后，試驗各組大鼠血清內t-PA含量增加，對應的纖維蛋白FIB含量減少，與模型組比，均具有顯著性差異(P<0.05)，說明恢復效果良好。其中，尿激酶作為t-PA直接作用藥物，尿激酶組大鼠血清中t-PA含量恢復最好，基本達到了空白組水平，與模型組比較具有極顯著性差異(P<0.01)。

以上說明，土鱉蟲活性肽組分F2治療“血瘀證”的機理可能是上調NO、t-PA，使血液內FIB含量減少，從而降低血液黏度，使血細胞指數下降。

3 結論

試驗將分離純化得到的纖溶活性肽進行藥效研究，采用高脂乳劑灌胃+高脂飼料飼養并結合注射鹽酸腎上腺素與冰水冷浴方法，復制大鼠急性血瘀證模型，以大鼠血細胞和血液流變分析，血脂四項(HDL、LDL、T-CHO、TG)為指標衡量土鱉蟲活性肽組分F2的治療作用，結果顯示F2組分能顯著降低大鼠血清內TG、T-CHO、HDL和LDL的含量，上調NO、t-PA使得FIB含量減少，從而降低血液黏度，改善血液流動性，土鱉蟲活性肽F2組分對急性血瘀模型大鼠產生了影響。說明采用上述工藝對土鱉蟲活性肽進行分離是可行的。同時也證明，土鱉蟲活性肽可能是土鱉蟲“活血化瘀”作用的重要物質。

試驗過程也存在一些不足，如：最終分離組分F2的氨基酸組成是否與活性之間存在緊密聯系，目前尚未知；分離組分F2究竟是通過哪種途徑或者通路來調控相關因子含量，試驗沒有涉及。針對存在的問題，后期會對F2組分進行LC-MS分析，獲得其氨基酸序列。并進行更加深入的研究，揭示其作用機制。