裸藻多糖提取工藝優化及抗氧化活性研究

葛智超 李 燕，2 施文正 郎 蒙

(1. 上海海洋大學食品學院，上海 201306；2. 上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306)

裸藻是古代原生動物眼蟲的植物學名稱，其細胞含有葉綠體，可進行光合作用，同時具有動物與植物兩種特性。因無細胞壁，裸藻有高達93.1%的高效吸收率，可有效吸收營養素。裸藻中含有豐富的營養成分，如維生素、礦物營養物、不飽和脂肪酸、多糖等。還具有清除有害膽固醇、重金屬，解決便秘、宿便的功能[1]。多糖具有抗癌、抗病毒、抗衰老、降血糖、降血脂、抑菌等功能，而有關裸藻多糖(Euglena Gracilis Polyccharides，EGPS)的研究報道較少。

目前，多糖的提取方法主要有傳統熱水提取法、堿提法、酸提法、超聲波提取法和酶工程提取法。傳統熱水提取法耗時、耗能且得率較低[2]，堿提法和酸提法容易斷裂多糖的糖苷鍵，導致結構和活性改變[3]。利用超聲波的空化作用使細胞易于破碎，有助于多糖溶出，而酶工程技術可在較溫和的條件下分解組織，加速多糖的釋放和提取[4]。這兩種方法具有高效、節能等特點，已被廣泛用于動植物有效成分的提取。試驗擬以裸藻為原料，采用超聲波輔助酶解對裸藻多糖提取工藝進行優化，并分析其抗氧化活性，為裸藻多糖的進一步開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

裸藻粉：德味生物科技(上海)有限公司；

枯草桿菌中性蛋白酶：酶活2.8×105U/g，上海源葉生物科技有限公司；

無水乙醇、三氯乙酸、重蒸酚、鐵氰化鉀、濃硫酸、三氯化鐵、菲啰嗪、L-抗壞血酸、過氧化氫、水楊酸等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

抗超氧陰離子自由基試劑盒：南京建成生物科技研究所；

超濾杯、超濾膜：MSC300，上海摩速科學器材有限公司；

2，2-聯苯基-1-苦基肼基：純度>98%，美國Sigma公司。

1.1.2 儀器與設備

真空冷凍干燥箱：CHRIST ALPHA1-2型，北京博勱行儀器有限公司；

冷凍離心機：GL-20G-11型，上海安亭科學儀器廠；

紫外分光光度計：UV-2000型，北京普析通用儀器有限責任公司；

超聲波處理器：FS-1200N型，上海生析超聲儀器有限公司；

旋轉蒸發儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 超聲波輔助酶解提取工藝 取一定量的裸藻粉末，按料液比1∶40 (g/mL)加入pH 7的磷酸鹽緩沖溶液，在一定的超聲功率下處理相應時間后加入中性蛋白酶，50 ℃下酶解一定時間，離心，取上清液，旋轉蒸發后的濃縮液加入8倍體積的無水乙醇，靜置24 h，TCA法除蛋白，冷凍干燥得裸藻粗多糖。

1.2.2 裸藻多糖含量測定 采用苯酚—硫酸法[5]測定多糖含量，葡萄糖標準曲線方程為A=0.015 6c，R2=0.997 2。按式(1)計算裸藻多糖得率。

(1)

式中：

c——多糖質量濃度，μg/mL；

V——總體積，mL；

n——稀釋倍數；

M——原料質量，mg。

1.2.3 單因素試驗設計

(1) 超聲功率：超聲時間25 min、中性蛋白酶添加量5%、酶解時間5 h，考察超聲功率(120，240，360，480，600 W)對裸藻多糖得率的影響。

(2) 超聲時間：超聲功率360 W、中性蛋白酶添加量5%、酶解時間5 h，考察超聲時間(5，15，25，35，45 min)對裸藻多糖得率的影響。

(3) 中性蛋白酶：超聲功率360 W、超聲時間25 min、酶解時間5 h，考察中性蛋白酶添加量(0%，1%，2%，3%，4%，5%)對裸藻多糖得率的影響。

(4) 酶解時間：超聲功率360 W、超聲時間25 min、中性蛋白酶添加量5%，考察酶解時間(2，3，4，5，6 h)對裸藻多糖得率的影響。

1.2.4 響應面試驗設計 在單因素試驗基礎上根據SPSS顯著性差異分析(P<0.05)，以超聲時間、中性蛋白酶添加量、酶解時間為試驗因素，以多糖得率為響應值，設計三因素三水平響應面試驗優化裸藻多糖提取工藝條件。

1.2.5 不同分子量段的裸藻多糖的制備 將裸藻粗多糖溶解，經超濾分離得>10(EGPS-1)，5～10(EGPS-2)，3～5(EGPS-3) kDa 3個分子量段裸藻多糖溶液，冷凍干燥備用。

1.2.6 不同分子量段裸藻多糖的抗氧化分析

(1) 超氧陰離子自由基清除率的測定：參照抗超氧陰離子試劑盒說明書進行測定[6]。

(2) DPPH自由基清除率的測定：參照Xie等[7]的方法。

(3) 羥基自由基清除率的測定：參照邵佳等[8]的方法。

(4) Fe2+螯合率的測定：參照萬茜淋等[9]的方法。

(5) 還原力的測定：參照Sun等[10]的方法。

(6) 脂質過氧化抑制率的測定：參照Khan等[11]的方法。

1.3 數據處理

采用SPASS 20對試驗所得數據進行顯著性差異分析(用不同字母表示)，單因素試驗、抗氧化試驗采用Origin 8.0作圖，響應面優化采用Design-Expert 8.0.6。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲功率 由圖1可知，多糖得率隨超聲功率的增強緩慢提高，當超聲功率為360 W時，多糖得率達到3.08%，繼續增大超聲功率，多糖得率趨于平穩。功率過大會使多糖的糖苷鍵斷裂，轉變為可溶于乙醇的單糖、寡糖或低聚糖，導致醇沉過程中的多糖得率下降[12]。因此，最佳超聲功率為360 W。

2.1.2 超聲時間 由圖2可知，多糖得率在超聲5～15 min 內顯著提升，隨后趨于平緩。超聲波作用時間太長，空化效應的作用力進一步破壞提取物中部分多糖的糖鏈，導致醇沉過程中多糖得率下降[13]。故最佳超聲時間為15 min。

圖1 超聲功率對多糖得率的影響Figure 1 The effect of ultrasonic power on the yield of polysaccharide

圖2 超聲時間對多糖得率的影響Figure 2 The effect of ultrasonic time on the yield of polysaccharide

2.1.3 酶解時間 由圖3可知，多糖得率隨酶解時間的延長(前3 h內)呈上升趨勢，表明與糖結合的蛋白質逐步被水解，有利于多糖的釋放溶出[14]。而隨著酶解時間(3 h 后)的繼續延長，中性蛋白酶活性逐步減弱，裸藻多糖得率提升不明顯，與葉洵璐等[14]的結論相似。故最佳酶解時間為3 h。

2.1.4 中性蛋白酶添加量 由圖4可知，多糖得率隨中性蛋白酶添加量的增加逐漸增大，當中性蛋白酶添加量達3%后，多糖得率趨于平穩，確定中性蛋白酶的最佳添加量為3%。

圖3 酶解時間對多糖得率的影響Figure 3 The effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of polysaccharide

圖4 中性蛋白酶添加量對多糖得率的影響Figure 4 The effect of the amount of neutral protease on the yield of polysaccharide

2.2 響應面優化設計

2.2.1 試驗設計與結果分析 根據單因素試驗結果，以多糖得率為響應值。根據Box-Benhnken中心組合原理進行響應面設計，試驗因素水平表見表1，試驗設計與結果見表2。

利用Design-Expert 8.0.6軟件對響應面試驗結果進行多元回歸擬合，得到以裸藻粗多糖得率(Y)為響應值的二次多項回歸方程：

Y=3.66+0.16A+0.18B+0.24C+0.14AB-0.022AC+0.085BC-0.37A2-0.24B2-0.39C2。

(2)

表1 試驗因素、水平及編碼Table 1 Experiment factors, levels and code

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 RSM design matrix and the responses

表3 多糖得率回歸模型系數的顯著性檢驗?Table 3 Regression coefficient and ANOVA test of the yield of polysaccharide

2.2.2 試驗因素間的交互作用 由圖5～7可知，酶解時間與中性蛋白酶添加量之間的相互作用顯著，其次為超聲時間與酶解時間的相互作用，最后是中性蛋白酶添加量與超聲時間。通過響應面的陡峭程度[15]可以看出，超聲時間影響最大，酶解時間的影響大于中性蛋白酶添加量，與方差分析結果一致。

圖5 酶解時間與中性蛋白酶的交互作用對多糖得率的影響Figure 5 The effects of enzymatic hydrolysis time, neutral protease and its interaction on the yield of polysaccharide

圖6 超聲時間與中性蛋白酶添加量的交互作用對多糖得率的影響Figure 6 The effects of ultrasound time, addition of neutral protease and its interaction on the yield of polysaccharide

圖7 超聲時間與酶解時間的交互作用對多糖得率的影響Figure 7 The effects of ultrasound time, enzymatic hydrolysis time and its interaction on the yield of polysaccharide

2.2.3 驗證實驗 經響應面優化法分析得到裸藻多糖的理論工藝條件為超聲時間18.57 min、中性蛋白酶添加量3.66%、酶解時間3.55 h，此條件下多糖得率的預測值為3.77%。為檢驗響應面結果的可靠性，對最優工藝參數進行驗證實驗(n=5)，根據實際操作情況，將驗證條件修正為超聲時間19 min、中性蛋白酶添加量3.7%、酶解時間3.5 h，此時實測多糖得率為3.68%，與預測值相差0.09%，證明用所建模型預測裸藻多糖得率是準確可行的。

2.3 不同分子量段裸藻多糖含量分析

超聲波輔助酶法制得的裸藻多糖粗提液經超濾膜分離后，各組分中EGPS-1、EGPS-2、EGPS-3含量分別為42.07%，21.75%，26.67%。

2.4 裸藻多糖抗氧化分析

2.4.1 羥基自由基清除率 由圖8可知，裸藻多糖對羥基自由基的清除能力隨樣品濃度增大逐漸增長[16]。EGPS-1、EGPS-2、EGPS-3分子量段的裸藻多糖達到IC50時的濃度分別為0.25，0.29，0.23 mg/mL，其中羥基自由基的清除效果相對較弱。高于陳藝煊EGPS-2對等[17-18]提取的小球藻多糖與羊棲菜多糖。

圖8 不同分子量段裸藻多糖對羥基自由基的清除效果Figure 8 The effect of different molecular weight euglena polysaccharides on hydroxyl radical scavenging

2.4.2 DPPH自由基清除率 由圖9可知，DPPH自由基清除率隨著VC的濃度增加逐漸上升，但試驗3個組分均無DPPH自由基清除效果(清除率均為0)，對比桑葉多糖的DPPH自由基清除率較弱[19]，可能是由于兩者多糖的結構不同所致。

圖9 不同分子量段裸藻多糖對DPPH自由基的清除效果Figure 9 The effect of different molecular weight euglena polysaccharides on DPPH-scavenging scavenging

2.4.3 超氧陰離子自由基清除率 由圖10可知，超氧陰離子清除率隨樣品濃度增加逐漸上升[22]，不同分子量段裸藻多糖在20 mg/mL后的清除率增長緩慢。EGPS-3組分的超氧陰離子清除能力較強，且高于其余兩段，當濃度為20 mg/mL時，EGPS-3的清除率達62.12%。高于劉洪超等[24]制備的羊棲菜多糖的，與殷玲等[22]制備的巢脾多糖的較為接近。

2.4.4 Fe2+螯合率 由圖11可知，裸藻多糖對Fe2+螯合能力隨樣品濃度的升高逐漸增強，當濃度為0.1 mg/mL后其螯合能力上升趨緩。各個分子量段裸藻多糖對Fe2+螯合能力較接近，IC50為0.06～0.08 mg/mL，均高于相同濃度下的陽性對照組及李正鵬等[20]研究的藍空地花菌多糖，說明各分子量段對Fe2+的螯合能力較強。

圖10 不同分子量段裸藻多糖對超氧陰離子自由基的清除效果Figure 10 The effect of different molecular weight of euglena polysaccharides on superoxide anion removal

圖11 不同分子量段裸藻多糖對Fe2+的螯合能力Figure 11 The chelating ability of euglena polysaccharides with different molecular weights for Fe2+

2.4.5 還原力 由圖12可知，EGPS-1、EGPS-3在20 mg/mL 時的還原力分別達到0.593，0.699，隨著濃度的進一步增加，還原力緩慢上升；EGPS-2在10 mg/mL時的還原力達0.170，隨后趨于平緩；還原力大小為EGPS-3>EGPS-1>EGPS-2。張寧等[21]研究的黑木耳分級多糖在20 mg/mL時的還原力達到最大值(1.023)，高于試驗結果。

圖12 不同分子量段裸藻多糖的還原力Figure 12 The reducing power of different molecular weight euglena polysaccharides

2.4.6 脂質過氧化抑制率 由圖13可知，脂質過氧化抑制率隨樣品濃度的增加逐漸上升，不同分子量段裸藻多糖在30 mg/mL時的抑制率達到較大值后趨于平穩。EGPS-1、EGPS-3的IC50分別為28.27，29.90 mg/mL，而EGPS-2的脂質過氧化抑制率較弱，在所選范圍內并未達到50%。當濃度為40 mg/mL時，EGPS-1、EGPS-2、EGPS-3的脂質過氧化抑制率分別為59.08%，32.09%，58.01%，低于張寧等[22]研究的黑木耳多糖。

圖13 不同分子量段裸藻多糖對脂質過氧化的抑制效果Figure 13 The effect of different molecular weight of euglena polysaccharides on lipid peroxidation

3 結論

裸藻多糖的最佳提取工藝為超聲時間19 min，中性蛋白酶添加量3.7%，酶解時間3.5 h，該條件下的多糖得率為3.68%。通過超濾將裸藻多糖分離成3個不同分子量段裸藻多糖，并對其進行體外抗氧化試驗，得出分子量為3～5 kDa的裸藻多糖的綜合抗氧化效果較好，其對Fe2+螯合率、羥基自由基清除能力、還原力、超氧陰離子自由基清除能力的效果最佳，各分子量段對DPPH自由基均無清除效果。后續可通過膜分離、色譜等方法對裸藻多糖進行進一步純化及結構鑒定。