畢赤酵母引導外源蛋白分泌的信號肽研究進展

鄒晨偉，黃義德

福建師范大學 生命科學學院，福建 福州 350117

第一株畢赤酵母于1920年被Guilliermond從法國栗樹上分離出來，命名為Zygosaccharomyces pastori[1]。1956年，Phaff在美國加利福尼亞的黑橡樹中分離得到畢赤酵母菌株，命名為Pichia pastoris[2]。1989年，Cregg等找到了強的AOX1啟動子，將畢赤酵母用于外源蛋白生產[3]。1995年，基于核糖體基因序列數據，Yamadat等將畢赤酵母歸到新屬Komagataella中[4]。該屬目前共有6個成員，即K.pastoris、K.phaffii、K.pseudopastoris、K.poluli、K.ulmi和K.kurtzmanii[5]。其中，K.pastoris和K.phaffii目前作為外源蛋白表達宿主。常用的外源蛋白表達菌株GS115和X-33屬于K.phaffii，SMD蛋白酶缺陷菌株如SMD1168則屬于K.pastoris。

2019年，Schutter等對K.phaffii全基因組進行測序，獲得了9.43 Mb的基因組序列，并為編碼基因提供人工注釋[6]。同年，Mattanovich等測定了K.pastoris的9.4 Mb基因組，并分析了分泌蛋白質組和糖轉運蛋白，以此建立了一個以畢赤酵母基因組為數據基礎的開放性網站（http://www.pichiagenome.org）[7]。這項工作為后來的畢赤酵母相關研究提供了便利的平臺，該網站時至今日仍在維護和更新。2011年Küberl等結合454和Illumina測序技術，提供了9.35 Mb的更加精確的K.phaffii基因組數據，該工作還報道了該菌種第一個線粒體基因組的完整DNA序列[8]。隨后的研究則是對之前基因組數據的不斷補充更新，2016年Sturmberger等給出了一組更為精確的K.phaffii參考基因組，主要是開放讀框和染色體定位的更新[9]。在基因組測序技術不斷迭代更新的背景下，這些測序工作為研究人員對畢赤酵母菌株進行基因工程改造打下了堅實的數據基礎。

1 α-factor信號肽

1.1 α-factor信號肽結構和功能

當前畢赤酵母系統中應用最廣也最為成功的信號肽是釀酒酵母的α-factor信號肽，因而它的結構和功能也得到了較為詳細的研究。α-factor信號肽是酵母α細胞分泌的交配信息素（mating factor 1，MF1）N端一段α交配因子前導肽，其編碼基因位于釀酒酵母的染色體XV1上[10]。

α-factor信號肽由86個氨基酸殘基組成，實則包含前肽（Pre-sequence）和前導區（Pro-region）序列。1～19位氨基酸殘基為Pre-sequence序列，20～86位殘基為Pro-region序列。其中，Pre-sequence 又分為 N-region（1～6）、H-region（7～15）和C-region（16～19）等3個不同的功能區。N-region是帶正電的極性氨基酸殘基；H-region是一段疏水性氨基酸序列，它的疏水性α螺旋結構能夠有效促進新生肽的轉運[10]；C-region由保守的中性氨基酸組成，能被Ⅰ型信號肽酶所識別切割[11]。Pro-region N端前6個氨基酸殘基為進化上保守的輸出信號6肽APVNTT，它們的共同特征是疏水性的脂肪鏈氨基酸。Pro-region是目前研究較多的部分，因為其長達66個氨基酸殘基，表明它有一定的結構和功能。據Chahal等研究，Pro-region由1個α螺旋和5個β折疊組成，如果57～60區間的氨基酸殘基全部被刪除，會改變Pro-region的結構，從而影響它的功能[12]。此外，在釀酒酵母中研究發現，Pro-region上有3個N-糖基化位點（N23，N57，N67），消除會導致α-factor的分泌量減少但不會消失，這表明N-糖基化對于多肽通過分泌途徑是重要的但不是必要的[13]。Pro-region糖基化可能有助于分泌效率的提高，研究表明適度糖基化有助于外源蛋白的表達[14]。此外，Proregion本身還存在自我聚集傾向，而N-糖基化能夠防止Pro-region在內質腔內的聚焦，從而提高分泌效率[15]。Pro-region還扮演分子伴侶的角色，提高所引導蛋白的有效折疊，減少內質網內未折疊蛋白通過內質網相關降解（endoplasmic reticulum associated degradation，ERAD）途徑被轉運到蛋白酶體中被降解[12]。

1.2 α-factor信號肽引導的外源蛋白在分泌通路中的加工

α-factor信號肽引導的外源蛋白在畢赤酵母中分泌要經過一系列加工過程。首先，α-factor信號肽引導外源蛋白進入內質網的膜轉位方式為翻譯后轉位[16]。在細胞質上的核糖體翻譯出包含α-factor信號肽和外源蛋白在內的全長未成熟蛋白。伴侶蛋白Hsp40和Hsp70阻止核糖體翻譯完成的多肽的廣泛折疊，以維持α-factor信號肽序列的未折疊狀態，使蛋白能夠順利靶向內質網并進入Sec復合物通道[17]。Sec復合物中主要相關的亞基有Sec61/62/63，Sec61作為多肽穿過內質網的通道，Sec63作為撐開該通道的支架，Sec62起到錨定作用[18]。細胞質中翻譯完成的多肽被轉運到Sec復合物中，α-factor信號肽Pre-sequence會被內質網膜上的信號肽酶復合物（signal peptidase complex，SPC）中的Ⅰ型信號肽酶（SPaseⅠ）切割[18]。蛋白進入內質網腔后，被內質網腔內熱激蛋白家族成員Bip/Kar2p輔助初步折疊[19]。第二步是進入內質網腔的初步折疊Pro-region和未成熟蛋白的早期N-糖基化[20]，在這個位置錯誤折疊蛋白的累積容易引起未折疊蛋白響應（unfold protein response，UPR）的上調[21]，然后錯誤折疊蛋白會通過ERAD途徑被運往溶酶體進行降解[22]。第三步則是Pro-region和外源蛋白通過COPⅡ囊泡轉運到高爾基體，在高爾基體中進行進一步的N-糖基化修飾和折疊[23]。在此期間信號肽的Pro-region與外源蛋白連接處的2個堿性氨基酸殘基KR被位于高爾基體上Kex2基因編碼的類枯草菌素蛋白酶（subtilisin-like protease，一種鈣離子依賴性絲氨酸蛋白酶）剪切[24]。該酶所識別的基序為KR/RR-X，這個切割過程需要鈣離子作為輔助因子進行[25]。隨后N端攜帶4個氨基酸殘基（EAEA）的成熟蛋白隨著分泌小泡向胞外前行，4個氨基酸殘基就在此過程中被位于液泡的STE13基因所編碼的二肽蛋白酶氨基肽酶A（dipeptidyl aminopeptidase A）所切割[26]，它所識別的基序是EA。這個切割過程是非常迅速的，因而不能保證百分之百的切割效率[27]。因此，分泌的外源蛋白上可能會殘留2或4個氨基酸殘基[28]。最后，成熟的外源蛋白通過胞吐方式分泌到胞外。

1.3 α-factor信號肽的改造

Jungoh等對α-factor信號肽進行了單個密碼子、密碼子上下文，以及單個和上下文聯用的密碼子優化，發現密碼子上下文的優化能夠使得南極假絲酵母脂肪酶CAL-B的產量達到野生型的4倍[29]?；贑hahal等對α-factor信號肽Pro-region的二級結構與分泌水平的相關性進行研究的背景[12]，Barrero等對Pro-region上的第42位亮氨酸和第83位天冬氨酸對應的密碼子進行點突變，發現42位亮氨酸突變成絲氨酸后有效減少了E2-Crimison在內質網上的聚集[30]。由于前面已有研究者發現Ost1信號序列能夠引導分泌蛋白進行翻譯共轉位[15]，他們還設計了一個由畢赤酵母Ost1蛋白信號肽和α-factor信號肽的Pro-region組成的混合分泌信號肽，結果表明這種改造使得具有高級結構且難以分泌的四聚體紅色熒光蛋白E2-Crimson和脂肪酶BTL2的分泌量分別增加了20倍和10倍[30]。以上研究表明對于畢赤酵母現有引導外源蛋白信號肽的改造和優化是可行的，這也為開發更為高效的信號肽提供了新的思路。

2 畢赤酵母內源信號肽

畢赤酵母自身會通過分泌途徑分泌蛋白到胞外、細胞膜/壁或不同細胞器中。Mattanovich等對畢赤酵母菌株DSMZ70382（K.pastoris）基因組測序后，對其分泌組（secretome）進行預測分析，結果顯示有88個蛋白分泌到胞外，另有172個開放讀框預計可以進入分泌途徑被轉運到不同的細胞器中[7]。還有其他一些研究也對畢赤酵母分泌蛋白進行了預測，預測的分泌蛋白中許多具有典型的信號肽序列[6,31-32]。這些畢赤酵母內源信號肽可以為分泌蛋白提供除α-factor信號肽之外更為廣泛的信號肽選擇。表1總結了研究者利用不同報告蛋白對其中一些信號肽進行的表達研究，研究結果顯示有些信號肽可有效引導外源蛋白的分泌。遺憾的是，迄今還沒有人對預測的所有內源信號肽引導外源蛋白分泌效果進行系統的研究。

表1 引導外源蛋白在畢赤酵母中表達的內源信號肽

3 結語

隨著畢赤酵母種屬信息的不斷完善，越來越多的外源蛋白能夠借由畢赤酵母表達系統得到不錯的產量。作為非常具有產業化發展前景的表達宿主，期望它未來在醫藥行業發光發熱。對α-factor信號肽的結構和功能及相關分泌通路的詳細研究，表明信號肽在協助胞外分泌中不可或缺，而目前對信號肽的改造大多處于摸索狀態。因此，后續還需要更全面更系統地對畢赤酵母αfactor信號肽的內源信號肽進行篩選和優化，以尋得能夠高效引導外源蛋白分泌的信號肽。