銅綠假單胞菌waaL突變體構建及糖基化系統的建立

徐涵，潘超，黃競，馮爾玲，朱力，王恒樑

軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京 100071

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）又名綠膿桿菌，是一種非發酵革蘭陰性菌，菌體細長，有單鞭毛和莢膜，無芽胞，具有易定植、易變異和多耐藥的特點，常感染于燒傷創面或皮膚、尿路和心臟瓣膜等解剖部位，引起術后感染[1-2]，或在機械通氣或慢性肺囊性纖維化患者中引起肺部感染[3]。目前對Pa感染的治療主要依靠抗生素，但Pa耐藥現象嚴重，泛耐藥甚至全耐藥的菌株不斷增多，使其可用的敏感藥物越發有限，因此Pa感染的治療也越來越困難[4-5]。除了抗Pa感染的藥物治療，疫苗接種也是其防控的重要策略，已有許多不同的抗Pa感染疫苗和幾種單克隆抗體被研制出來，但只有少數達到了臨床階段，尚無相應的產品上市[5]。

脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是革蘭陰性菌外膜的主要成分，在細菌黏附和防御中起重要作用，同時也是Pa重要的毒力因子[6]。LPS由脂質A、核心多糖和O-抗原多糖（O-antigen polysaccharide，OPS）三部分組成，OPS位于脂多糖的最外層。Pa的O-抗原連接酶由waaL基因編碼，負責將合成于內膜胞質側的OPS在周間質中連接到脂質A核心上合成LPS[7]。研究表明，針對OPS的抗體可介導針對Pa感染的高水平免疫力[8]。

多糖結合疫苗是目前最為成功的細菌性疫苗形式[9-10]。它是將病原菌表面多糖與底物蛋白偶聯，使T細胞得以參與免疫應答并產生高親和力的抗體和免疫記憶。近年來，多個利用化學法生產的多糖結合疫苗已經上市。研究發現，糖蛋白在細菌體內的合成途徑與LPS合成非常相似，存在于周間質的游離多糖在糖基轉移酶或O-抗原連接酶的催化下，可以從脂質載體轉移至底物蛋白或脂質A核心。利用這種相似性，可以通過對LPS合成途徑改造，將OPS連入目標載體蛋白，從而制備多糖結合疫苗。

在本研究中，我們首先通過同源雙交換法缺失了編碼銅綠假單胞菌PAO1株O-抗原連接酶的基因waaL，使PAO1株無法合成完整的LPS，并在周間質中積累“游離”的OPSPa。之后，我們在缺失株中轉入構建的具有四環素抗性的O-連接糖基化工程載體，即共表達腦膜炎耐瑟球菌的糖基轉移酶PglL和帶有糖基化序列的重組霍亂毒素B亞 單 位（recombinantcholera toxin B subunit，rCTB），細菌周間質中的“游離”OPSPa在PglL催化下轉移到rCTB，形成糖蛋白，證明了利用這種生物方法制備Pa多糖結合疫苗的可行性，為下一步糖蛋白純化、疫苗制備及效果評估奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

銅綠假單胞菌PAO1株由本實驗室保存，培養于液體LB培養基（0.5%酵母粉、1%氯化鈉和1%蛋白胨）或含1.5%瓊脂的固體LB培養基，培養溫度為37℃；大腸桿菌DH5α感受態細胞購自全式金生物有限公司，培養基及培養溫度同上。為了誘導蛋白表達，細菌首先在37℃的液體LB培養基中培養至D600nm值約為0.6時，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，并在30℃繼續培養10 h。根據需要，加入四環素（50 μg/mL）用于質粒的選擇。

糖基工程質粒pET28a-PglL-rCTB（表達PglL和底物蛋白rCTB）[10]，僅表達底物蛋白rCTB的質粒pET28a-rCTB，抗性擴增質粒pCasPA、pJQ200SK以及自殺質粒pCVD442均由本實驗室保存；限制性內切酶BglⅡ、XbaⅠ及SmaⅠ購自NEB公司；質粒提取試劑盒、DNA凝膠產物回收及PCR產物回收試劑盒購自江蘇康為世紀生物科技有限公司；API50CHB試紙條購自Biomerieux公司；引物由北京天一輝遠公司合成。

1.2 銅綠假單胞菌PAO1株waaL基因的敲除及驗證

用同源雙交換法敲除PAO1株的waaL基因，流程如圖1。根據PAO1株waaL基因及上下游序列，設計構建打靶片段所需引物（表1）。以PAO1株為模板，用引物waaL-5F/waaL-5R擴增上游同源臂，用引物waaL-3F/waaL-3R擴增下游同源臂；以pJQ200SK質粒為模板，用引物Gm-F/Gm-R擴增慶大霉素抗性基因（Gm）；之后將waaL基因上游同源臂、Gm抗性基因、waaL基因下游同源臂通過融合PCR技術連接，得到完整打靶片段ΔwaaL::Gm（上游同源臂-Gm抗性基因-下游同源臂），再將其與SmaⅠ酶切的自殺質粒pCVD442相連，獲得打靶質粒pCVD442-ΔwaaL::Gm。將pCVD442-ΔwaaL::Gm電轉化具有性菌毛的大腸桿菌β2155，獲得供體菌β2155/pCVD442-ΔwaaL::Gm，并將供體菌與Pa受體菌接合，在Gm平板（含Gm 50 μg/mL）上篩選獲得Gm抗性的Pa克?。ɑ蚪M整合有打靶質粒），命名為PAO1/pCVD442-ΔwaaL::Gm。以基因組上waaL上下游同源臂以外的一對引物waaL-outF/waaL-outR及Gm內部引物Gm-seqF/Gm-seqR組合成5′端交叉引物（waaL-outF/Gm-seqR）和3′端交叉引物（Gm-seqF/waaL-outR）進行此次重組的驗證。取數個驗證成功的PAO1/pCVD442-ΔwaaL::Gm克隆菌液涂布于含10%蔗糖（含Gm 50 μg/mL，不含NaCl）的LB平板上，培養至生長出單克隆，利用SacB基因內部引物SacBF/SacB-R、waaL基因內部引物waaL-F/waaL-R和外部引物waaL-outF/waaL-outR篩選waaL基因被Gm抗性基因插入打斷的克隆，命名為PAO1ΔwaaL。

表1 基因敲除引物

圖1 同源雙交換法基因敲除簡圖

1.3 銅綠假單胞菌PAO1株及waaL基因缺失株的LPS銀染

取培養后的菌液1 mL，5000 r/min離心1 min后收集菌體，加入 100 μL 1×SDS緩沖液重懸。沸水浴10 min，冷卻至室溫，加入10 μg蛋白酶K，60℃消化2 h。離心取上清進行SDSPAGE，待溴酚藍出膠后，將膠取出浸沒于固定液（10%冰乙酸，40%無水乙醇）中振蕩30 min，其間更換一次固定液，置于增敏液（0.1%硫代硫酸鈉，6.8%乙酸鈉，30%無水乙醇，0.25%戊二醛）中振蕩30 min，用ddH2O洗3次，每次15 min；加入銀染液（0.25%硝酸銀，0.04%甲醛）反應20 min，用ddH2O洗2次，每次1 min；加入顯影液（2.5%碳酸鈉，0.04%甲醛，0.006%硫代硫酸鈉），觀察LPS的顏色，在反應到顏色最佳時倒入終止液（1.46%乙二胺四乙酸二鈉）終止反應。

1.4 銅綠假單胞菌PAO1株及waaL基因缺失株的生長代謝狀況測定

將銅綠假單胞菌PAO1株及waaL基因缺失株同時接種培養于50 mL液體培養基中，記錄12 h的菌液D600nm值；將PAO1野生株和waaL基因缺失株同時在LB固體培養基上培養過夜，用API 50CHB試紙條對野生株和缺失株的糖代謝水平進行測定，比較2株菌的糖代謝差異。

1.5 四環素抗性表達載體構建

由于Pa為耐藥菌株，因此我們選擇PAO1菌株敏感的四環素（tetracycline，Tet）抗性，以質粒pCasPA為模板擴增Tet片段［引物為Tet-F（5′-G AAGATCTTGGCGTACTGTTGTGGT-3′，下劃線序列為BglⅡ酶切位點）、Tet-R（5′-GCTCTAGATATAG CTTGCCGGAAGTC-3′，下劃線序列為XbaⅠ酶切位點）］后用限制性內切酶BglⅡ和XbaⅠ雙酶切，并與經同樣雙酶切的糖基工程質粒pET28a-PglL-rCTB和對照質粒pET28a-rCTB連接，得到帶有Tet抗性的糖基工程質粒pET28a-PglL-rCTB-Tet及對照質粒pET28a-rCTB-Tet，將2個質粒分別電轉PAO1野生株和PAO1ΔwaaL感受態細胞。

1.6 銅綠假單胞菌PAO1株及waaL基因缺失株的糖蛋白誘導表達及驗證

挑取含有對應質粒的克?。╬ET28a-PglL-rCTB-Tet/PAO1，pET28a-rCTB-Tet/PAO1，pET28a-PglL-rCTB-Tet/PAO1ΔwaaL，pET28a-rCTB-Tet/PAO1ΔwaaL）接種于5 mL LB液體培養基，培養至菌液D600nm至2.0時，按1∶100轉接于5 mL LB液體培養基，37℃培養至菌液D600nm為0.6～0.8時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，30℃培養10 h誘導蛋白表達。次日，每個樣品取1 mL，5000 r/min離心1 min收集菌體沉淀，加入1×SDS緩沖液重懸，沸水浴10 min后進行SDS-PAGE，用鼠源HRP-Anti-His tag抗體進行Western印跡檢測。

2 結果

2.1 銅綠假單胞菌PAO1株waaL基因缺失株的PCR驗證

用同源雙交換法敲除PAO1株的O-抗原連接酶waaL基因，首先在受體菌PAO1與供體菌大腸桿菌β2155/pCVD442-ΔwaaL::Gm接合后，在Gm抗性平板上隨機挑選10個克隆，在插入位置兩端分別用上游交叉引物waaL-outF/Gm-seqR和下游交叉引物Gm-seqF/waaL-outR進行PCR鑒定，在5′端插入位置用waaL-outF和Gm-seqR引物PCR驗證將有1644 bp的片段產生，在3′端插入位置用Gm-seqF和waaL-outR引物驗證將有1369 bp的片段產生，結果（圖2A、B）顯示多個克隆兩側插入位置都有預期長度的擴增片段，即第一次交換成功。

選擇第9號克隆接種于5 mL LB培養基，于30℃培養過夜，次日取50 μL培養液鋪于含10%蔗糖的LB平板（含Gm 50 μg/mL），30℃培養至單克隆形成。隨機挑選10個單克隆，分別接種于5 mL LB 培養基（含 Gm 50 μg/mL），30℃培養過夜。取少量菌液用自殺質粒pCVD442上SacB基因的內部引物進行PCR鑒定，結果見圖2C，全部克隆均為陰性擴增，即已發生二次重組。

選取3號陽性克隆用waaL基因外部引物和內部引物進行PCR擴增，發現野生株、缺失株均有特異性擴增產物且長度與預期符合。外部引物Gm基因插入菌株的擴增長度為2989 bp，野生株擴增長度為2427 bp（圖2D）；內部引物Gm基因插入菌株的擴增長度為1046 bp，野生株擴增長度為208 bp（圖2E）。同時經測序比對，與設計一致，將這一缺失株命名為PAO1ΔwaaL。

圖2 銅綠假單胞菌PAO1株waaL基因缺失株的PCR鑒定

2.2 銅綠假單胞菌PAO1株及waaL基因缺失株的表型和生長代謝狀況驗證

用PCR驗證了PAO1株waaL基因缺失之后，采用LPS銀染在菌株表型上對敲除進一步驗證，結果如圖3A。敲除waaL基因后，PAO1ΔwaaL無法檢測到LPS典型的梯狀條帶，表明PAO1ΔwaaL中的waaL基因O-抗原連接功能已失活，無法將OPSPa連接于脂質A核心。進一步對waaL缺失后的生長代謝進行評估，通過對野生株和缺失株的生長曲線進行測定，發現二者的生長速度和趨勢無明顯差異（圖3B）；利用API50CHB試紙條分析糖利用情況，除了甘油、核糖代謝稍有差異之外，其他糖代謝無明顯差異（圖3C，表2），表明waaL缺失對菌株生長和代謝無明顯影響。

表2 API50CHB試驗條0～9管底物

圖3 PAO1野生株和waaL基因缺失株的表型及生長代謝狀況驗證

2.3 底物蛋白的表達及糖基化驗證

在確定waaL基因缺失成功后，我們對缺失株中的“游離”OPSPa能否被PglL識別并催化連接于底物蛋白進行了驗證。將糖基工程載體分別導入野生株PAO1和缺失株PAO1ΔwaaL，同時以只表達底物蛋白的載體為對照,得到含有對應質粒的克?。╬ET28a-rCTB-Tet/PAO1，pET28a-PglL-rCTB-Tet/PAO1，pET28a-rCTB-Tet/PAO1ΔwaaL，pET28a-PglL-rCTB-Tet/PAO1ΔwaaL），IPTG 誘導后，通過Western印跡檢測糖基化表達情況，結果如圖4。野生株和缺失株中轉入只表達底物蛋白的載體pET28a-rCTB-Tet時，均能觀察到底物蛋白rCTB的表達，相對分子質量約為15 000。rCTB與PglL共表達時，理論上“游離”的OPSPa在PglL催化下連接于rCTB，因此相對分子質量增加，在Western印跡上顯示為蛋白條帶向上遷移；然而，在野生株中糖基化條帶非常微弱，幾乎不可見（圖4A）。而當缺失株中轉入糖基化表達載體并誘導表達后，與野生株條帶相比，在相對分子質量35 000～45 000處有明顯的梯狀糖基化條帶，說明糖基轉移酶PglL能將OPSPa轉移到載體蛋白rCTB上，產生了糖蛋白rCTB-OPSPa（圖4B）。與野生株相比，waaL基因的缺失使得糖基化效率顯著增加。

圖4 底物蛋白rCTB的糖基化驗證

3 討論

Pa的LPS是其重要的毒力因子，在對常用抗生素產生耐藥性方面具有重要作用，LPS結構的持續變化是Pa適應慢性感染的關鍵因素[11]。特別的是，Pa能產生2種不同形式的LPS，分別稱為A帶和B帶，二者均具有免疫原性。A帶為普通多糖抗原，普遍存在于Pa，一般是D-鼠李糖（DRhaB）的均聚物；B帶是一種血清型特異性脂多糖，可作為血清分型的依據，一般是由3～5種不同單糖組成的雜聚物。PAO1菌株的B帶為2-乙酰氨基-3-乙酰氨基-2，3-二脫氧甘露醛酸（Man［2NAc3N］a）、2，3-二乙酰氨基-D-甘露糖酸（2，3-diNAcManA）和2-乙酰氨基-2，6-二脫氧-D-半乳糖（N-乙酰巖藻糖胺；Fuc2NAc）組成的重復單元[12-13]。OPS通常被認為是Pa的主要保護性抗原，也是細菌的主要毒力因子，因此可以作為疫苗研發的靶點[14]。因此，我們對PAO1的waaL基因進行敲除，在缺失株中建立了糖基化系統，將其OPS連入載體蛋白，可用于后期制備Pa的多糖結合疫苗。

Pa的耐藥機制較為復雜，能夠通過多種方式對抗生素產生耐藥性[15]，給臨床治療用藥的選擇帶來了困難。目前尚無安全可靠的抗Pa感染疫苗，亞單位疫苗是研究熱點。有研究者將純化的Pa的OPS分子與Pa外毒素A結合，合成了八價多糖結合疫苗，盡管免疫效果較好，但由于種種原因仍未能上市[14]。多糖結合疫苗已成為預防病原菌感染最有效的手段之一，因此它可能會成為抗Pa傳染的重要手段。糖基化系統的建立是多糖結合疫苗研發過程中的關鍵一步[16]。本研究中，我們應用了本實驗室自主構建的O-連接糖基化系統，得到了連接有PAO1株OPSPa的糖蛋白。糖基工程載體由PglL和CTB兩個關鍵部分組成，PglL寬松的底物特異性已在多個菌株中得到驗證；CTB是已知的最有效的黏膜佐劑之一，具有五聚體結構，可以為抗原提供更復雜的結構，有利于抗原提呈激發更有效的免疫應答[9-10]，我們在CTB基礎上添加了糖基化識別位點，成功使其糖基化。PAO1株O-抗原連接酶waaL基因的敲除使得OPS在周間質累積，導入糖基工程載體之后，由于缺少waaL的競爭，“游離”的OPSPa被PglL轉移到rCTB底物蛋白上，糖基化效率遠遠高于PAO1野生株，證明了敲除waaL基因的必要性。通過建立糖基化系統，我們合成了Pa糖蛋白結合物，下一步將會對糖基化產率以及多糖特異性進行進一步驗證。

綜上，我們敲除了PAO1株的O-抗原連接酶基因，并在菌體內表達了連接有OPS的糖蛋白，為后續抗體制備、菌株進一步減毒以及其他表達驗證做了前期準備，并驗證了O-連接糖基化系統可以在Pa中成功應用，進一步擴寬了該系統的應用范圍。雖然尚有一些問題需要解決，比如目前還不確定與底物蛋白結合的OPS為A帶還是B帶，以及糖蛋白結合疫苗的保護性仍待評價，但缺失株的構建以及糖蛋白的成功表達作為Pa多糖結合疫苗的前期探索，已經為后續糖蛋白的純化和免疫實驗打下了堅實的基礎，具有極大的拓展性。