miRNA-192靶向調控WT1在高糖誘導足細胞EMT中的作用

李夢嵐 譚琴 徐秀

1武漢市中心醫院內分泌科 430000; 2華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院腎內科，武漢 430000

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是由糖尿病引起的腎臟微血管病變。研究發現，足細胞損傷是DN的主要發病機制，主要包括足細胞肥大、上皮-間充質轉化(EMT)、足細胞脫落和凋亡等。腎病蛋白(nephrin)是足細胞成熟的標志性分子，具有維持足細胞完整和腎小球濾過功能的作用。研究表明，在各種蛋白尿性腎臟疾病以及腎小球疾病的動物模型中，腎病蛋白的表達降低，且腎病蛋白的低表達與足細胞損傷及腎臟疾病的進展有關。微小RNA(microRNA，miRNA)作為小分子非編碼RNA可通過抑制或降解靶基因mRNA，參與生物體的多種生理及病理過程。在DN患者的腎組織中可見特異性miRNA的表達，其在一定程度上可反映患者病情的改變。最近研究表明，miRNA-192在腎臟病理生理過程中起關鍵作用，miRNA-192的表達與DN有關。Wilms腫瘤蛋白1(WT1)是Wilms瘤抑癌基因，在腎組織中特異性表達于足細胞，是足細胞的標志蛋白。本實驗通過高糖誘導足細胞并檢測miRNA-192及WT1的表達水平，探討二者在高糖誘導足細胞損傷中的作用機制，為臨床治療DN提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗主要試劑 人腎小球足細胞(human podocyte cell，HPC)、葡萄糖(均購自美國Sigma公司)、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)、Lipofectamine 2000[購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司]、miRNA-192抑制劑及其陰性對照(均購自上海吉瑪生物科技公司)、Trizol、miRNA-192、U6引物(Invitrogen公司)、WT1、轉化生長因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、GAPDH普通PCR上下游引物(上海生工公司)、WT1兔單克隆抗體(ab224806)、腎病蛋白兔單克隆抗體(ab227806)、TGF-β1小鼠單克隆抗體(ab190503)、α-SMA兔單克隆抗體(ab32575)、β-actin兔單克隆抗體(ab179467，美國Abcam公司)、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(購自美國LI-COR公司)。

1.1.2 細胞培養及分組 足細胞復蘇后在含10%胎牛血清及5.5 mmo1/L葡萄糖的RPMI 1640培養基中，于33℃、5% CO培養箱培養，每2 d換1次液，待細胞生長至細胞融合80%時用含0.05%胰蛋白酶的消化液進行消化傳代，然后轉入37℃、5% CO培養箱分化14 d。選取在37℃條件下分化為樹枝狀的HPC為研究對象，并將細胞分為4組：A組為空白對照組：細胞正常培養(5.5 mmo1/L葡萄糖)，不做處理；B組為高糖組：在細胞中加入30 mmol/L葡萄糖；C組為陰性對照組：在細胞中轉染終濃度為50 nmol/L的miRNA NC，轉染6 h后加入30 mmol/L葡萄糖進行培養；D組為miRNA-192抑制組：在細胞中轉染終濃度為50 nmol/L的miRNA-192 Inhibitor，轉染6 h后加入30 mmol/L葡萄糖進行培養。細胞處理后繼續培養48 h進行后續實驗。

1.2 觀察指標

1.2.1 采用Western印跡檢測各組足細胞表面標志蛋白腎病蛋白、WT1、TGF-β1、α-SMA的蛋白表達水平 收集各組對數生長期細胞提取總蛋白，取40 μg與上樣緩沖液混合，100℃加熱5 min后通過10% SDS-PAGE電泳分離，90 V電壓轉膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，洗膜后加入腎病蛋白、WT1、TGF-β1、α-SMA一抗4℃過夜，以辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2 h，用化學發光法顯色，凝膠成像系統拍照。以β-actin為內參，每組實驗重復3次。

1.2.2 qRT-PCR檢測各組細胞miRNA-192、WT1、TGF-β1、α-SMA mRNA表達水平 取各組細胞分別加入1 ml Trizol，混合均勻后冰上裂解5 min，12 000 g離心15 min；取上清加入200 μl氯仿，充分混勻后冰上靜置10 min，12 000 g離心10 min；棄上清，加入75%乙醇7 500 g離心5 min，室溫晾干，加入DEPC水溶解。按照逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉成cDNA，取1 μl cDNA作為模板進行qRT-PCR擴增。反應條件：預變性95℃ 5 min，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環后72℃延伸10 min。每個樣本重復檢測3次。miRNA-192上游引物：5′-CGCGGCTGACCTATGAATTG-3′，下游引物：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。每組基因的相對表達量按公式(2法)計算。引物設計見表1。

表1 qRT-PCR檢測各基因引物序列

1.2.3 miRNA-192與WT1基因的靶向關系 采用雙熒光素酶報告基因實驗驗證miRNA-192與WT1基因的靶向關系。本實驗通過分別擴增出含miRNA-192結合位點的WT1 3′UTR序列(tcTTGTCTAACATTCCCGAGGTCAg)及miRNA-192結合位點突變的WT1 3′UTR序列(tcTTTTCTAACAGTCCCGGTTCCAg)，將其插入到熒光素酶報告基因載體(psiCHECK2)上，構建野生型WT1-Wt和突變型WT1-Mut重組質粒。根據Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行轉染，按照1 μg重組質粒，2 μl Lipofectamine 2000比例稀釋后，將其與Lipofectamine 2000混合液分別與miRNA-192抑制劑及陰性對照共轉染至足細胞中，置于37℃培養箱繼續培養6 h后更換為新鮮的、含有10%胎牛血清的培養基中培養48 h，收集并裂解細胞，12 000 g離心5 min，取上清用于測定，按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 各組細胞腎病蛋白的蛋白表達水平 與A組相比，B組和C組腎病蛋白的蛋白表達水平顯著降低(=444.404，<0.05)；與C組相比，D組腎病蛋白的蛋白表達水平升高(=16.519，<0.05)，見圖1。

2.2 各組細胞miRNA-192的相對表達量 與A組相比，B組和C組miRNA-192相對表達量顯著升高(=184.216，<0.05)；與C組相比，D組miRNA-192相對表達量降低(=10.533，<0.05)，見圖2。

2.3 各組細胞WT1蛋白及mRNA的表達水平 與A組相比，B組和C組WT1蛋白及mRNA表達水平均顯著降低(=243.543，<0.05；=107.898，<0.05)；與C組相比，D組WT1蛋白及mRNA表達水平升高(=17.088，<0.05；=8.186，<0.05)，見圖3。

2.4 miRNA-192與WT1基因的靶向關系驗證 雙熒光素酶報告基因實驗分析結果顯示，miRNA-192與WT1基因3′-UTR存在互補結合位點，miRNA-192與WT1能夠靶向結合。熒光素酶活性檢測結果顯示，抑制miRNA-192后可明顯促進熒光素酶活性；而將WT1的3′-UTR突變后，熒光素酶活性無變化，見圖4。

2.5 各組細胞TGF-β1、α-SMA蛋白及mRNA表達水平 與A組相比，B組、C組TGF-β1、α-SMA蛋白及mRNA表達水平均顯著升高(=69.014，<0.05；=87.644，<0.05；=147.714，<0.05；=247.584，<0.05)；與C組相比，D組TGF-β1、α-SMA蛋白及mRNA蛋白表達水平均降低(=6.114，<0.05；=7.941，<0.05；=8.239，<0.05；=8.481，<0.05)，見圖5。

3 討論

DN是造成終末期腎功能衰竭最普遍的原因，也是主要的糖尿病微血管并發癥之一，是全世界腎臟病患者發病和死亡的主要原因。足細胞是一種高度分化的腎小球上皮細胞，其形態及功能異常是DN白蛋白尿產生及腎小球纖維化的重要原因之一。研究表明，miRNA在DN的發生、發展過程中發揮重要作用。miRNA-192是在腎臟組織中尤其是系膜細胞中特異性表達的miRNA，可調控系膜細胞的增殖和凋亡并促進腎纖維化，與DN的發生、發展密切相關。陳月英等研究發現，miRNA-192水平在DN患者尿液中表達顯著升高，且與腎功能損傷程度相關。動物實驗研究發現，糖尿病小鼠腎皮質中miRNA-192的表達增加，用體內缺乏miRNA-192基因的小鼠建立糖尿病模型后，腎組織纖維化及肥大程度減輕，白蛋白尿排泄率下降。本研究采用高糖誘導足細胞，結果發現，與A組相比，B組和C組腎病蛋白的蛋白表達水平顯著降低，而miRNA-192相對表達量升高；與C組相比，D組腎病蛋白的蛋白表達水平升高、miRNA-192相對表達量降低。提示高糖可導致足細胞miRNA-192表達水平升高，足細胞功能損傷；抑制miRNA-192表達后可減輕足細胞損傷。

miRNAs是一類可對基因表達進行轉錄后調控的分子，其可通過下游靶點對機體生長、發育、分化及凋亡等生理過程的調控起重要作用。WT1是一種轉錄因子，參與足細胞分化并維持足細胞的功能，其在成熟足細胞中高度表達，研究發現，腎小球硬化小鼠的成熟足細胞中WT1基因表達顯著降低。高原等研究發現，IgA腎病患者腎組織WT1表達降低，促進腎小管上皮細胞轉分化，加重腎間質纖維化。本研究結果發現，高糖誘導足細胞中WT1基因表達降低，與C組相比，D組WT1蛋白表達水平及mRNA表達水平升高；進一步對miRNA-192與WT1基因的靶向關系進行驗證，結果發現，miRNA-192與WT1基因3′-UTR存在互補結合位點，miRNA-192與WT1能夠靶向結合。提示miRNA-192可能通過靶向調控WT1，在高糖誘導足細胞損傷中發揮重要作用。

研究發現，損傷的腎小管上皮細胞誘導成纖維細胞和肌成纖維細胞積累，并通過EMT最終導致小管間質纖維化和慢性腎臟疾病的進展。DN時足細胞轉分化僅有EMT相關表型蛋白的表達變化，主要表現為上皮表型蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、緊密連接蛋白1、腎病蛋白等表達逐漸缺失，同時間質表型蛋白基質金屬蛋白酶-9、TGF-β1及α-SMA等表達增加。在DN小鼠模型中發現，腎小球miRNA-192的表達增加與TGF-β活性增強有關，對腎臟miRNA-192的特異性抑制作用可降低腎組織纖維化并抑制白蛋白尿反應。本研究結果發現，與A組相比，B組和C組TGF-β1、α-SMA蛋白及mRNA表達水平均顯著升高；與C組相比，D組TGF-β1、α-SMA蛋白及mRNA蛋白表達水平均降低，提示高糖誘導足細胞發生EMT，促進DN的發展；抑制miRNA-192的表達可減輕高糖誘導的足細胞EMT。

綜上所述，高糖誘導的足細胞miRNA-192表達升高并靶向調控WT1促進DN的發展，其作用機制可能與足細胞EMT有關；抑制miRNA-192的表達可減輕高糖誘導的足細胞EMT，為今后DN的預防和治療提供新思路。但miRNA-192是否通過靶向WT1促進足細胞EMT，有待進一步研究。